雷公藤紅素通過NF-κB阻斷尿酸鈉晶體誘導的痛風性關節炎大鼠炎性分子表達

曹帆帆, 張登海, 楊哲軍, 王 瑩, 徐莉敏

(1. 上海市浦東新區公利醫院·上海市炎癥與慢病管理人工智能重點實驗室,上海 200135;2. 上海市浦東新區高行社區衛生服務中心檢驗科,上海 201208; 3. 上海市浦東新區公利醫院檢驗科,上海 200135)

痛風性關節炎(gouty arthritis, GA)是由于嘌呤代謝紊亂,導致血液尿酸濃度過高,繼而沉積在關節組織后引起的炎癥反應,發作期典型臨床表現為突發的關節紅腫熱痛,常見于第一跖趾關節,受累關節劇痛,治療以抗炎鎮痛為主[1-3]。目前,GA發作時,秋水仙堿為其首選藥物。但是,秋水仙堿是一種高毒性生物堿,其中毒劑量與治療劑量相近,常引發如腹瀉等胃腸道不良事件,有嚴格的禁忌證和明顯的毒副作用[4-5]。因此,尋找新的藥物用于急性痛風性關節炎的治療,有重要的臨床意義。

雷公藤俗稱斷腸草、山砒霜,系衛矛科雷公藤屬植物,其主要功效作用是治療腎炎、皮膚病、類風濕性關節炎等[6-8]。雷公藤紅素是我國學者從雷公藤根部提煉出的第一個醌甲基三萜類化合物。本團隊和其他的研究均發現,在多個實驗動物疾病模型中,雷公藤紅素顯示出對多種炎癥具有治療潛能[9-11]。研究認為,GA是由尿酸鈉晶體(monosodium urate monohydrate crystals, MSU)沉積在關節周圍而引起的炎癥反應。MSU沉積可引起關節液中炎癥因子水平顯著升高,從而導致關節及周圍組織局部充血水腫,發生炎癥反應。因此,由MSU誘導的GA動物模型可模擬人類GA的發病機制[12-13]。本研究擬觀察雷公藤紅素對MSU誘導的痛風性關節炎大鼠的治療作用,并初步探討其作用的可能機制,為雷公藤紅素治療痛風性關節炎提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 試劑

雷公藤紅素購自美國Sigma公司,由上海中山醫院藥劑科提取及純化,方法見以前報道[14]。尿酸(貨號U2875)購自美國Sigma公司;蘇木精和伊紅染料(BASO)、IL-8和COX-2 ELISA試劑盒購自武漢貝茵萊生物科技有限公司;GDPH引物和IL-8試劑盒由上海捷瑞生物工程有限公司合成;NO檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所;RIPA組織細胞快速裂解液(貨號R0010)購自北京索萊寶科技有限公司;BCA蛋白定量試劑盒(貨號PICPI23223)購自美國賽默飛公司;發光液(貨號WBKLS0100)購自美國密理博公司;p-P65(貨號Ab89299)和Rabbit抗Rat P65(貨號Ab16502)購自英國艾博抗公司;羊抗兔HRP標記二抗(貨號A0208)購自上海碧云天生物技術公司。

1.2 主要儀器

石蠟切片機(型號SQ 2125)、熒光顯微鏡(型號DM 6000 B)為德國Leica公司生產;正置顯微鏡(型號CX 41)為日本Olympus公司生產;酶標儀(型號352型)為芬蘭MS公司生產;Real-time檢測儀(型號ABI-7300)為美國ABI公司生產;電泳儀(型號mini protean 3 cell)為美國BIO-RAD公司生產;電轉儀(型號PS-9)為大連競邁科技有限公司生產;成像系統(型號T anon-5200)為上海Tanon公司生產。

1.3 動物實驗

1.3.1 實驗動物 雄性SD大鼠,180200 g,購自上海斯萊克實驗動物有限公司。

1.3.2 模型制備 1 g尿酸溶解于200 mL沸水中(含6 mL 1 N NaOH),加入鹽酸,調節溶液的最終pH值至7.2。將溶液冷卻并在室溫下攪拌,然后在4 ℃儲存過夜。沉淀物過濾、低溫干燥,并過孔徑250 pm的金屬網篩過篩,然后,尿酸結晶(大小為525 μm)混合在0.9%鹽水的注射液[含10% Tween-80(吐溫-80)],終濃度為20 mg/mL。模型制備前,測量大鼠左、右后足踝關節下0.5 mm處的周長作為0 h測量值。乙醇消毒雙后足腳踝處,用4號注射針頭,取20 mg/mL的尿酸鈉混懸液50 μL,注入大鼠右后支內踝的脛跗關節腔內,大鼠左側注射相同體積的PBS作對照。

1.3.3 動物分組及處理 實驗分為4組,每組4只大鼠: 對照組(腹腔注射雷公藤紅素溶解液DMSO),雷公藤紅素組(簡稱紅素組),MSU誘導的模型組和雷公藤紅素干預組(MSU+cel,簡稱紅素干預組)。16 h后重新測量鼠左、右后足踝關節下0.5 mm處的周長,處死動物,分別收集滑膜和軟骨以及關節腔內組織液,進行后續檢測。

1.4 病理切片

滑膜和軟骨置于10%甲醛中固定48 h;經過洗滌、脫水、透明、浸蠟和包埋處理后,組織切成厚約47 μm的組織片,然后進行HE染色,最后進行封片。結果用顯微鏡(200倍)觀察。

1.5 ELISA檢測

按試劑說明書操作。每孔加入50 μL不同濃度標準品及40 μL樣品,空白對照孔加入同體積標準品稀釋液。每孔繼而加入10 μL稀釋過的生物素化抗體。封板膜蓋上,37 ℃孵育30 min。棄去孔內液體,每孔加入300 μL 1×洗滌液;靜置1 min后,棄去孔內液體,并拍干。洗滌重復3次。每孔再加入50 μL Streptavidin-HRP,蓋上封板膜后室溫孵育20 min。棄去孔內液體,每孔加入300 μL 1×洗滌液;靜置1 min后,棄去孔內液體,拍干。洗滌重復3次。每孔加入100 μL TMB,室溫避光,孵育1030 min。每孔加入終止液50 μL,選擇波長450 nm的酶標儀,10 min內讀取吸光度(A450)值。按標準曲線計算樣品中細胞因子含量。

1.6 Real-time PCR

1.6.1 組織處理及總RNA提取 取組織于1 mL的TRIzol的勻漿管中,于勻漿機勻漿20 s,立即放于冰上;然后置于超凈臺中,溫育5 min,12 000 r/min,離心10 min(離心半徑10 cm);吸取上清液,并加入氯仿200 μL,搖勻,室溫靜置2 min。于4 ℃ 12 000 r/min,離心10 min(離心半徑10 cm);吸取上清液,加入異丙醇600 μL,混勻,室溫靜置15 min。于4 ℃ 12 000 r/min,離心15 min(離心半徑10 cm),棄上清液;加入1 mL 75%無水乙醇漂洗,于4 ℃ 12 000 r/min,離心5 min(離心半徑10 cm),棄上清液;加入1 mL無水乙醇,漂洗,于4 ℃ 12 000 r/min,離心5 min(離心半徑10 cm),棄上清液,室溫干燥10 min;加入40 μL DEPC水溶解RNA,置于-80 ℃保存備用。

1.6.2 cDNA制備 提取的RNA首先進行DNA消除,然后進行反轉錄(體積為25 μL)。取1 ng的RNA與1.5 μL Olig-dT 12-18及6 U(在生物酶中使用U表示限制性內切酶的活性單位,1 min內能轉化1 μmol底物的酶量稱為1酶單位)RNA酶抑制劑混合,以30 U AMV反轉錄酶于37 ℃作用1 h,85 ℃ 5 min,4 ℃,5 min后,獲得cDNA,可作為后續PCR反應模板。

1.6.3 Real-time PCR擴增 采用熒光定量PCR試劑盒。反應液組成(體積為25 μL): cDNA模板為2 μL(雙蒸水稀釋3倍),qPCR預混液12.5 μL,IL-8上下游引物(引物F 5′-CAATGAGTCGGCTG-GAGAAC-3′,Primer R 5′-AGGTGCTGAAGTCCTT-AGGG-3′)各0.5 μL,加雙蒸水至25 μL。GAPDH內參引物(Primer F 5′-GTCGGTGTGAACGGA-TTTG-3′,Primer R 5′-TCCCATTCTCAGCCTTGAC-3′)。反應程序: 反應程序: 95 ℃,10 min(95 ℃,15 s;60 ℃,45 s)×40;95 ℃,15 s;60 ℃,1 min;95 ℃,15 s;60 ℃,15 s。數據采用儀器自帶軟件(ABI Prism 7300 SDS 軟件)進行分析。

1.7 NO檢測

按試劑說明書進行NO檢測。對照液、待測樣本和標準液各100 μL,分別加入產品中試劑一和試劑二各200 μL,混勻,37 ℃,水浴60 min。然后再分別加入產品中試劑三和試劑四200 μL和100 μL,充分旋渦混勻30 s,室溫靜置10 min,3 5004 000 r/min,離心10 min,取上清液500 μL與顯色劑600 μL混合,室溫靜置10 min,550 nm測各管吸光度(A550)值。

1.8 western印跡法檢測

蛋白樣品中加入上樣緩沖液,95 ℃煮5 min,制備好的蛋白樣品凍存于-20 ℃備用。取適量蛋白上樣,同時上樣蛋白分子量標記。將電壓調至100 V進行電泳分離,待蛋白進入分離膠層后,將電壓調至200 V,繼續進行電泳分離至溴酚藍條帶跑出膠外。將電壓調至100 V轉膜90 min。剪下所需條帶,封閉液室溫封閉2 h。再加入抗P65和p-P65抗體,4 ℃孵育過夜。用TBST液洗膜3次,每次10 min,再加入相應二抗,室溫孵育1 h,并用TBST洗膜3次,每次10 min,最后用化學發光法顯影檢測。

1.9 統計學處理

2 結 果

2.1 雷公藤紅素對痛風性關節炎大鼠足腫脹的影響

用尿酸鈉注射后,觀察不同的時間點發現到16 h模型組大鼠才觀察到變化,因此選擇16 h時間點作為觀察點。與對照組相比,16 h后,尿酸鈉晶體導致模型組大鼠踝關節明顯腫脹,兩組差異有統計學意義(P<0.01),見圖1A。雷公藤紅素干預組與模型組相比,作用16 h后,沒有觀察到雷公藤紅素對尿酸鈉晶體導致的足腫脹有抑制作用(P>0.05),表明雷公藤紅素本身對SD大鼠的踝關節沒有影響(圖1B)。對照組大鼠滑膜組織無炎性細胞浸潤,無組織水腫及血管充血等現象。組織細胞間距疏松,且排列有序,均勻一致。模型組大鼠滑膜組織表層受損,增生明顯,血管內充血、管腔變形增大,炎性細胞排列緊密,且紊亂簇集。與模型組相比,相同倍數視野中,雷公藤紅素干預組炎性細胞數量更少,炎性細胞排列間距更為疏松,且血管充血現象明顯減少(HE,200倍),見圖1C。

圖1 雷公藤紅素對痛風性關節炎大鼠足腫脹的影響Fig.1 Effect of celastrol on foot swelling in rats with gouty arthritisA: 尿酸鈉晶體作用16 h后,大鼠踝關節明顯腫脹;B: 大鼠左后足踝關節足周長作為對照,右后足踝關節足周長與對照相比作為縱坐標數值,MSU誘導的模型組踝關節明顯腫脹,而雷公藤紅素對尿酸鈉晶體導致的足腫脹無抑制作用,**P<0.01;C: 各組踝關節組織切片圖

2.2 雷公藤紅素對痛風性關節炎大鼠關節腔液炎性分子分泌的影響

與對照組相比,尿酸鈉晶體對踝關節有強烈刺激作用,模型組大鼠關節腔液內的炎性分子IL-8和COX-2水平升高,兩組差異有統計學意義(P<0.01)。雷公藤紅素本身對SD大鼠關節腔液內的炎性分子IL-8和COX-2水平沒有影響,與對照組相比,兩者差異無統計學意義(P>0.05),但能抑制尿酸鈉導致的炎性分子IL-8和COX-2水平升高;紅素干預組與模型組相比,兩組差異有統計學意義(P<0.01),見圖2A、B。

圖2 雷公藤紅素對痛風性關節炎大鼠關節腔液炎性分子分泌的影響Fig.2 Effect of celastrol on secretion of inflammatory molecules in joint cavity fluid of rats with gouty arthritisA: 各組大鼠關節腔液IL-8水平比較;B: 各組大鼠關節腔液COX-2水平比較;**P<0.01

2.3 雷公藤紅素對痛風性關節炎大鼠關節滑膜和軟骨組織IL-8 mRNA轉錄的影響

與對照組相比,尿酸鈉晶體會強烈刺激踝關節,模型組大鼠關節軟骨和滑膜組織的炎性分子IL-8 mRNA轉錄水平顯著增加,兩組差異有統計學意義(P<0.01)。雷公藤紅素本身對SD大鼠關節滑膜和軟骨組織的炎性分子IL-8 mRNA轉錄水平沒有影響,與對照組相比,兩者差異無統計學意義(P>0.05),但能顯著抑制尿酸鈉導致的炎性分子IL-8 mRNA水平升高(圖3A、B);紅素干預組與模型組相比,兩組差異有統計學意義(P<0.01)。

圖3 雷公藤紅素對痛風性關節炎大鼠關節滑膜和軟骨組織IL-8 mRNA轉錄的影響Fig.3 Effect of celastrol on IL-8 mRNA transcription in synovial and cartilage tissues in rats with gouty arthritisA: 各組大鼠滑膜組織IL-8 mRNA轉錄水平比較; B: 各組大鼠軟骨組織IL-8 mRNA轉錄水平比較;**P<0.01

2.4 雷公藤紅素對痛風性關節炎大鼠踝關節NO水平的影響

與對照組相比,尿酸鈉晶體對踝關節有強烈刺激作用,模型組大鼠關節腔液內的NO水平升高,兩組差異有統計學意義(P<0.01)。雷公藤紅素本身對SD大鼠關節腔液內的NO水平沒有影響,與對照組相比,兩者差異無統計學意義(P>0.05),但能抑制尿酸鈉導致的炎性分子NO水平升高;紅素干預組與模型組相比,兩組差異有統計學意義(P<0.01),見圖4。

圖4 雷公藤紅素對痛風性關節炎大鼠踝關節NO水平的影響Fig.4 Effect of celastrol on NO levels in ankle joint of rats with gouty arthritis**P<0.01

2.5 雷公藤紅素對痛風性關節炎大鼠滑膜組織NF-kB活化的影響

與對照組相比,尿酸鈉晶體對踝關節有強烈刺激作用,模型組大鼠關節滑膜組織的P65活化顯著增加,兩組差異有統計學意義(P<0.01)。雷公藤紅素本身對SD大鼠關節滑膜關節滑膜組織的P65活化沒有影響,與對照組相比,兩者差異無統計學意義(P>0.05),但能顯著抑制尿酸鈉導致的關節滑膜組織P65的活化;紅素干預組與模型組相比,兩組差異有統計學意義(P<0.05),見圖5。

圖5 雷公藤紅素對痛風性關節炎大鼠滑膜組織NF-kB活化的影響Fig.5 Effect of celastrol on activation of NF-kB in synovium of rats with gouty arthritisA: Western印跡法檢測條帶圖;B: p-P65統計圖;**P<0.01,*P<0.05

2.6 雷公藤紅素對痛風性關節炎大鼠軟骨細胞NF-kB活化的影響

與對照組相比,尿酸鈉晶體對踝關節有強烈刺激作用,模型組大鼠關節軟骨組織的P65活化顯著增加,兩組差異有統計學意義(P<0.01)。雷公藤紅素本身對SD大鼠關節軟骨組織的P65活化沒有影響,與對照組相比,兩者差異無統計學意義(P>0.05),但能顯著抑制尿酸鈉導致的關節軟骨組織P65的活化;紅素干預組與模型組相比,兩組差異有統計學意義(P<0.05),見圖6。

圖6 雷公藤紅素對痛風性關節炎大鼠軟骨組織NF-kB活化的影響Fig.6 Effect of Tripterygium on activation of NF-kB in cartilage of rats with gouty arthritisA: Western印跡法檢測條帶圖;B: p-P65統計圖;**P<0.01,*P<0.05

3 討 論

尿酸鈉結晶析出并沉積于關節滑膜組織內,導致關節組織釋放炎性因子,引發無菌性炎癥,是GA發作的主要機制之一。因此,研究認為,治療急性痛風性關節炎的主要策略是阻斷關節組織釋放炎性因子[4,15]。本團隊最近的研究發現,雷公藤紅素能抑制MSU導致的關節組織釋放炎性因子,這種作用與其抑制轉錄因子NF-κB活化有關。

急性痛風性關節炎的病理實質是炎癥,其病理機制為血管的異常,包括血管擴張,炎性滲出,炎性分子的表達在紅、腫、熱這幾方面起主要作用,并引起中性粒細胞等炎性細胞在炎癥部位的聚集。在急性痛風性關節炎發作時,尿酸鈉導致關節組織分泌炎性介質如IL-8、COX-2、NO等,這些介質能募集中性粒細胞到達炎癥部位,引發炎癥的級聯反應[16]。在動物模型中,MSU誘導的大鼠急性痛風性關節炎,能導致模型鼠踝關節腫脹,本研究首先觀察雷公藤紅素對關節腫脹的作用,結果發現僅僅干預16 h雷公藤紅素未能緩解模型鼠的足腫脹,這可能與雷公藤紅素作用時間過短有關,雷公藤紅素的干預效果有待進一步觀察。但是,本研究在觀察雷公藤紅素對MSU導致的炎性介質表達升高的作用時發現,在蛋白水平,雷公藤紅素能抑制MSU導致的炎性分子IL-8和COX-2水平升高,在轉錄水平,雷公藤紅素對IL-8的轉錄有強烈的抑制作用。另外,NO在痛風性關節炎中亦起重要作用。本研究也觀察了雷公藤紅素對MSU誘導的NO生成的影響,結果與其他研究觀察一致,MSU能誘導關節組織生成NO增加,而雷公藤紅素能抑制其誘導的NO生成。

近年的多個研究表明,MSU晶體作為一種危險信號,能與單核/巨噬細胞表面的蛋白CD14/16結合,刺激細胞膜表面Toll樣受體4(Toll-like receptor 4, TLR 4)[17-18]。TLR4與髓樣分化因子(my-eloid differentiation factor88, MyD88)結構中的羧基端產生作用,募集白細胞介素-1受體相關激酶(IRAK),IRAK被活化后作用于TNF受體相關因子6(TRAF6),并在IκB激酶(IκB Kinase, IKK)催化下激活NF-κB,活化的NF-κB通路可調節諸多炎性因子的合成和釋放,介導炎性反應完成。與其他研究相符,本研究也觀察到,MSU能導致關節的滑膜和軟骨組織表達與炎性相關的轉錄因子NF-κB表達增加,并且活性明顯升高。在這過程中,雷公藤紅素對滑膜和軟骨組織的NF-κB表達量和磷酸化均有明顯的抑制作用,這表明雷公藤紅素抑制MSU導致的炎性介質的釋放,與其抑制NF-κB表達和活化有關。研究認為,雷公藤紅素可能是通過直接作用于IKK而抑制NF-κB的活性[19]。IKK是NF-κB信號通路的一個關鍵成員。在非活化狀態,NF-κB被抑制蛋白IκB隔離至細胞質中,受到外界刺激后,IKK被激活,從而使IκB蛋白磷酸化,最終導致NF-κB活化,轉位至細胞核內促進多種基因的轉錄。研究發現,雷公藤紅素能夠有效抑制IKK的激活,從而阻止NF-κB的核轉位[20]。

綜上所述,雷公藤紅素在體內能抑制MSU導致的炎性介質IL-8、COX-2和NO的釋放,這種抑制效果與其能抑制MSU導致的NF-κB表達和活化有關。這些研究表明,雷公藤紅素作為治療急性痛風性關節炎的候選藥物,值得進一步研究。