農作物種子轉基因成分檢測能力驗證樣品制備技術分析與總結

張 英 劉 冰 張海波 楊娟妮 張 田 陳國瑛 馬亞琴

（陜西省種子工作總站，西安 710018）

能力驗證是通過檢驗機構間的檢測結果，來判定其出具檢驗數據的準確性、可靠性是否符合規(guī)定要求的合格評定活動[1]。農作物種子檢驗機構能力驗證，是了解掌握種子檢驗機構工作開展情況的重要渠道，也是評價種子檢驗機構技術水平高低的重要依據。能力驗證樣品制備是能力驗證工作正常開展的重要保障。

陜西省農作物種子檢驗站近年來多次承擔各類不同轉基因成分檢測能力驗證和比對樣品的制備，用于考核通過的檢驗機構的能力驗證、檢驗機構能力考評和實驗室內/間的儀器比對。工作中，陜西省農作物種子檢驗站科學合理地設計樣品制備方案和測試方案，通過符合性驗證、均勻度測試、嚴格質量控制等手段，保質保量、科學高效地完成了樣品制備和測試工作，為評價檢驗機構轉基因成分檢測能力提供了強有力的技術支撐。

1 工作開展情況

陜西省農作物種子檢驗站從2014 年開始承擔各類轉基因成分檢測樣品的制備工作，共計制備樣品2800 余份。制備的樣品涉及玉米、棉花、油菜、大豆、水稻等5 種作物，檢測參數涵蓋CaMV35S啟動子、NOS終止子、Cp4-epsps基因、Bt基因、Bar/pat基因、Bt11 轉化體、MOM810 轉化體、TC1507 轉化體、BT176 轉化體、NK603 轉化體、NK603×TC1507 轉化體、DBN9936 轉化體、TT51-1 轉化體、GTS40-3-2 轉化體、GT73 轉化體、RF3 轉化體、抗蟲棉等，共計2 個調控元件、3 個目的基因、12 個轉化體，基本覆蓋了國內常見的轉基因作物及常見的轉化體。

表1 列舉了陜西省農作物種子檢驗站每年轉基因成分檢測樣品的制備情況。從表1 可以看出，轉基因成分檢測制備樣品的轉基因含量從最初的0 和1.0% 2 個梯度，增加到0、0.5%和1.0% 3 個梯度，樣品份數從最初2014 年的100 份，增加到2022 年的400 份，說明參與轉基因成分檢測能力驗證的種子質量檢驗機構數量有所增加，能力驗證樣品的需要也在穩(wěn)步增加，這與“十三五”期間對各省種子質量檢驗機構加大資金投入和能力建設密切相關。

表1 2014-2022 年轉基因成分檢測能力驗證樣品制備匯總

2 主要做法

2.1 樣品設計陜西省農作物種子檢驗站綜合考慮了目前國內外轉基因作物的商業(yè)化情況、不同轉基因作物的分子特征以及近幾年違規(guī)轉基因的檢出情況，確定樣品類型、檢測參數和轉基因含量。樣品選擇粉末形態(tài)，以保證均勻性。檢測參數選擇實際檢測工作中常見的調控元件、目的基因和轉化體。轉基因含量方面，0 和1.0% 2 個梯度用于測試檢驗機構正確檢出全部參數的基本能力，0.5%梯度用于測試檢驗機構的能力水平。一般情況下，轉基因植物及產品成分檢測標準中定性PCR 陽性對照轉基因含量為0.1%～1.0%，檢出限一般在0.05%～0.10%之間；且已報道的轉基因檢測方法，如依賴于凝膠電泳的PCR、多重PCR、實時熒光PCR、數字PCR 等，檢出限一般在0.01%～0.50%[2]。為確保能力合格的檢驗機構能夠按照檢測標準檢出陽性樣品，且考慮到樣品制備和運輸過程中產生的小量誤差，2014年將能力驗證中陽性樣品轉基因含量水平設置為1.0%，2016 年考慮到參加轉基因成分檢測能力驗證的種子檢驗機構數量增加，且檢驗機構能力水平不斷提升，為了更有效地區(qū)分不同檢驗機構的能力水平，增設了0.5%的轉基因含量梯度。

2.2 方案制定樣品制備需要制定科學且詳細的方案、程序和工作計劃，一方面確保樣品制備的各個環(huán)節(jié)按照程序規(guī)范開展，另一方面確保各環(huán)節(jié)在計劃時間內完成，從而保質保量、按時完成樣品制備。與常規(guī)的轉基因成分檢測工作相比，能力驗證樣品的獲取來源、制備方法、制備要求、預期效果的驗證、分裝包裝、運輸保存都有特殊的要求[2]，需要制定專門的方案。

2.3 設施和環(huán)境的準備

2.3.1 設置工作區(qū)域為了減少污染，選擇與分子檢測區(qū)域不同樓層的種子常規(guī)質量檢測室用于能力驗證樣品的粉碎、分裝和包裝。樣品核酸提取、擴增和電泳分析則使用原有的PCR 檢測功能區(qū)。不同工作區(qū)配備專用的儀器、設備、試劑、耗材和實驗服等。各工作區(qū)嚴格按照單向流動的原則工作，避免不同樣品間的交叉污染[3]。

2.3.2 選擇原始樣品按照制備樣品的檢測對象、檢測參數、轉基因含量、樣品組合、樣品數量等要求，選擇經過反復檢測驗證的樣品作為制備材料，確保樣品質量穩(wěn)定可靠。

2.3.3 購置設備耗材能力驗證樣品需要對能力驗證輪次、樣品編號、作物種類、重量等內容進行標識。為了高效、高質量地完成樣品的分裝及包裝工作，陜西省農作物種子檢驗站專門購置了鋁箔封口機、標簽打印機及塑料分裝瓶、封口膜、標簽打印紙、自封袋等配套耗材，用于樣品瓶口的封裝和標簽的設計打印。

2.4 樣品制備制備過程中要按照制備程序規(guī)范操作，保證制備工作嚴謹精確，自始至終堅持無污染原則。

2.4.1 樣品粉碎樣品粉碎按照轉基因含量從低到高的順序，先粉碎陰性樣品再粉碎陽性樣品。粉碎機的配件要做到“一樣一杯一刀座”，粉碎陰性樣品的配件清洗后可繼續(xù)使用，為避免污染，粉碎陽性樣品的配件使用后應丟棄。

2.4.2 樣品稱量將粉碎后的陽性樣品按照比例與陰性樣品混合，制備成不同轉基因含量的陽性對照和陽性樣品。混合過程中可使用混勻儀等設備充分混合，確保均勻度，同時避免不同樣品間的交叉污染和對工作環(huán)境的污染。

2.4.3 樣品分裝和標識樣品分裝封口過程應盡量減少污染。標簽標注時應做到及時準確，不能將樣品混淆。按照陰性樣品、陰性對照、陽性樣品、陽性對照的順序分裝與標識。采取分裝一批、封口一批、標識一批的方法進行，分裝每一批樣品之前要對環(huán)境進行充分徹底地清理。標識的標簽應包括作物種類名稱、驗證輪次、樣品編號、重量等內容。

2.5 樣品測試樣品測試是樣品制備工作最重要的質量控制手段，包括3 個階段，分別是制樣前原材料質量測試、封裝前均勻性測試、封裝后符合性測試。

2.5.1 原材料質量測試用于樣品制備的原材料，使用前應進行質量測試。原材料粉碎后隨機取3～5個樣品，進行符合性檢測和轉基因含量測定，符合預期結果的材料方可用于樣品制備。

2.5.2 封裝前均勻性測試樣品研磨完成后，在封裝前應對樣品進行均勻性測試。均勻性測試采用實時熒光PCR 法。每個陽性樣品隨機取5 份粉末，進行轉基因含量測試。對于轉基因含量為1%的樣品，重復間的差異應小于0.2%，平均值與預期值的差異應小于0.1%。對于轉基因含量為0.5%的樣品，重復間的差異應小于0.1%，平均值與預期值的差異應小于0.05%。超差的樣品應重新進行混合，直至符合預期結果。符合預期結果的材料方可用于樣品封裝。

2.5.3 封裝后符合性測試樣品封裝完成后，將每類分裝好的樣品規(guī)則擺放，每類樣品隨機取3～5 個樣品，依據能力驗證作業(yè)指導書要求，對每個檢測參數進行符合性測試。結果須與預期一致。若不一致，要查找原因并及時改正，重新測試一致后方可放行。

2.6 樣品包裝與運輸樣品一般采用加厚塑料小瓶包裝，鋁箔封口。每組樣品包括驗證樣品、陽性對照和陰性對照。每組樣品用自封袋雙層包裝，外層自封袋標注組號，在降低樣品損壞和污染可能性的同時，方便能力驗證的組織實施單位查詢樣品檢測結果[2]。

2.7 樣品信息保密樣品編號隨機生成，至少保證每10 年內樣品編號不重復。每次能力驗證活動結束前，嚴格保密樣品編號、檢測結果、制備單位等相關信息，任何人不得向能力驗證組織實施單位以外的單位及個人透漏信息[4]。

3 經驗及建議

3.1 采用可靠的原始樣品原始樣品的符合性和轉基因含量是樣品制備工作的基礎。原材料須經過轉基因成分檢測，并使用歐洲標準物質局（IRMM）認證的轉基因標準物質進行轉基因含量的測定。符合性測試和轉基因含量測定均符合預期的原材料方可作為原始樣品制備能力驗證樣品。

3.2 始終堅持防污染原則防污染是轉基因檢測的重點，可以有效避免假陽性或假陰性結果的產生。為了有效區(qū)分不同檢驗機構的能力水平，能力驗證設計的陽性樣品數量遠大于日常的轉基因檢測任務。為避免大量陽性樣品粉碎時產生的粉末污染PCR 檢測功能區(qū)的工作環(huán)境，造成假陽性，制備能力驗證樣品時最好選擇與分子檢測不同的樣品粉碎區(qū)。粉碎時要注意及時清理工作環(huán)境，充分清洗粉碎機配件。

3.3 嚴格進行質量控制在檢測環(huán)節(jié)設置對照樣品是對檢測質量進行監(jiān)控的最有效方式。制備的樣品在測試過程中應設置空白對照、陰性對照和陽性對照，在保證檢測結果準確可靠的同時，也能檢測反應體系是否污染、反應體系是否有效擴增[3]。

3.4 采用籽粒形態(tài)的樣品作為以后的能力驗證樣品為了確保樣品的均勻性，避免出現假陰性結果，能力驗證樣品一直采用粉末形態(tài)，而種子檢驗機構日常工作中接受委托的樣品，一般都是籽粒形態(tài)的。為了適應這一實際情況，且保證能力驗證樣品的均勻性，陜西省農作物種子檢驗站已經進行了相應的研究摸索，具有了一定的技術儲備。

能力驗證是考核實驗室檢測結果一致性和準確性、監(jiān)督實驗室質量管理過程、識別實驗室存在問題的一種驗證活動[2]。隨著我國轉基因技術商業(yè)化的不斷推進，轉基因生物安全監(jiān)管的范圍和難度日益增加。種子質量檢驗機構作為農業(yè)轉基因安全監(jiān)管的技術支撐，通過能力驗證評價其技術能力和質量管理水平十分重要。

樣品制備的穩(wěn)定可靠、均勻一致則是能力驗證活動有效開展的前提保障[4]。近年來陜西省農作物種子檢驗站多次承擔了轉基因成分檢測樣品的制備工作，在工作中獲取了很多關于樣品制備的經驗與教訓，并為以后能力驗證制備工作的進一步提高做了相關研究和儲備，為能力驗證樣品制備工作更為科學、規(guī)范地開展提供參考。