廣西特有植物麗萼熊巴掌開花物候與繁育系統研究

陳宇嬌, 王滿蓮, 唐 輝, 李 虹, 張秀姣, 劉寶玉, 郝 敏

(1.桂林理工大學, 廣西 桂林 541006; 2.廣西壯族自治區中國科學院廣西植物研究所, 廣西 桂林 541006;3.廣西植物功能物質與資源持續利用重點實驗室, 廣西 桂林 541006)

麗萼熊巴掌(PhyllagathislongiradiosaC. Chen var.pulchellaC. Chen)為野牡丹科(Melastomataceae)錦香草屬(Phyllagathis)多年生草本植物,屬大葉熊巴掌(P.longiradiosa)的一個變種,常生于海拔200～900 m的石灰巖闊葉林下或蔭濕處,屬廣西特有植物,喀斯特專性植物,局限分布在廣西壯族自治區崇左市的馬山縣、龍州縣、大新縣[1-2],該物種是廣西傳統壯藥,壯名果媽那產,全株入藥,具有清熱利濕、活血調經等功效[3],植株株型緊湊,葉色常年為綠色或淡紫色,葉背紫紅色,花色鮮艷,花期早于同科植物,具有極高的園林開發潛力,可馴化后用作地被或室內觀賞植物。課題組在桂林植物園對麗萼熊巴掌進行了多年的引種馴化,發現麗萼熊巴掌在桂林生長良好,花期集中,花量大,群體花期1月左右,觀賞性很強,但其落花落果嚴重,結實極少甚至不結實,極大限制了對該種的研究和開發利用。

植物繁育系統是包括花部特征、開花、傳粉、受精、種子發育、花器官各部位壽命、傳粉者種類和頻率、自交親和程度以及交配系統等有性特征總和[4]。系統研究植物的開花物候和繁育系統有利于了解限制其繁育過程的影響因子,從而通過人為干預,促進生物多樣性保護。目前,已有對同科的細葉野牡丹(MelastomaintermediumDunn)[5]、毛菍(MelastomasanguineumSims)[6]、枝毛野牡丹(Melastomadendrisetosum)[7]、白花野牡丹(Melastomacandidumf.albiflorumJ. C. Ou)[8]等繁育系統的研究,但尚未見有關麗萼熊巴掌繁育系統的研究報道。本研究以麗萼熊巴掌引種居群為試驗對象,觀測其花部形態、花期物候、花粉活力,柱頭可授性等特征,并結合套袋實驗,探究其繁育系統類型及結實率較低的限制因素,為該種的種質資源保育和雜交育種研究提供基礎材料,便于今后對麗萼熊巴掌進行藥用開發和園林應用研究,豐富廣西藥用植物景觀資源種類,建立廣西特色鄉土植物景觀。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及研究地概況

2012 年將采自廣西壯族自治區左崇市馬山縣石山的麗萼熊巴掌,扦插繁殖后,2013年露地栽培于廣西植物研究所內(110°18′ E、25°4′ N,海拔162 m),現已形成人工種群。試驗地屬亞熱帶季風氣候,氣候溫和、雨量充沛、光照充足、四季分明,無霜期316 d,年均溫19.1 ℃,年有效積溫6.34 ℃,雨水集中于夏季,秋季干旱多風,年均降雨量1 750 mm。

1.2 研究方法

1.2.1花期物候觀察

2022年的3月隨機選取50株麗萼熊巴掌,記錄始花期(植株花朵開放約5%的日期)、盛花期(植株花朵開放約50%的日期)及末花期(植株約95%花朵凋謝的日期);并對單株始花日(第一朵花開放的日期)、終花日(最后一朵花開放的日期)、單花序始花日、終花日、每日開花數、開花高峰期進行觀察記錄[9]。

1.2.2花部形態觀測

隨機選取50株麗萼熊巴掌,從中標記100朵單花,每天觀察記錄單花花部形態變化,包括花瓣、雌雄蕊空間位置的變化、柱頭顏色變化直至凋謝[9]。隨機選取20朵已經完全盛開的花朵,用游標卡尺測量花冠直徑、雌蕊長度、花絲長度、雄蕊藥粉囊長度、萼筒長度、花梗長,記錄雄蕊數、花萼顏色、花瓣數量、柱頭顏色。隨機選取50個花序統計單花序花蕾數[7]。

1.2.3花蜜分泌狀況檢測

隨機選取20朵即將開放的花朵用細眼網紗袋套袋。花開后在07:00—17:00時之間,每隔2 h用10 μL微吸管檢測是否分泌花蜜[8]。

1.2.4雜交指數的估算

隨機選取20朵花,測量記錄花朵直徑、柱頭和花藥的空間位置、花藥開裂與柱頭可授性的時間間隔。依據Dafni[10]的標準估算雜交指數值。

1.2.5花粉-胚珠比測定

隨機摘取即將開放的花蕾帶回實驗室,選取3朵花各取1枚花藥,細心解剖,將花粉全部移至刻度試管中,用蒸餾水定容至1.5 mL。在振蕩機內充分搖勻后,用移液槍吸取0.1 μL的花粉懸液于血球計數板上,在顯微鏡下觀察并統計花粉數,每個重復3次,計算單花藥平均花粉數,乘以花藥數即為單花花粉數。隨機選取10朵花的子房進行解剖,于體視顯微鏡下觀察統計單花胚珠數[5]。

花粉胚珠比=單花花粉總量/單花胚珠數。

1.2.6花粉粒、柱頭形態結構觀察

摘取完全盛開的花朵,用鑷子夾取雄蕊,彈花粉至載玻片上,在顯微鏡下觀察花粉粒形態。隨機選取100個花粉粒,測量極軸和赤道軸,計算平均值與兩者比值(P/E)。在體視顯微鏡下觀察柱頭形態并拍照。

表1 麗萼熊巴掌種群開花進程Table 1 Flowering process of P. longiradiosa var. pulchella population

1.2.7花粉活力與柱頭可授性

晴天隨機采集松蕾期(柱頭剛冒出,花瓣還未伸展開)、盛花期(柱頭完全冒出,花瓣完全展開)、末花期(柱頭完全冒出,花瓣合攏)以及謝花期(花瓣及雄蕊脫落,僅余柱頭)的花朵,帶回實驗室。盛花期和末花期的花粉活性測定用I2-KI法、MTT染色法和TTC法[9],5次重復。用聯苯胺-過氧化氫法測定柱頭可授性。將不同花期的花朵柱頭切下,浸入聯苯胺反應液(V1%聯苯胺∶V3%過氧化氫∶V蒸餾水=4∶11∶22),若柱頭處有大量氣泡出現,則證明柱頭具可授性,5次重復。

1.2.8套袋實驗

參照林秋金等[5]的方法進行以下6種處理:

1) 對照,不做任何處理,檢測自然條件下的傳粉情況;

2) 不去雄、不授粉,在柱頭伸出前進行套袋(硫酸紙,下同),檢測是否存在主動自交;

3) 不去雄,人工自花授粉后套袋,檢測是否自交親和;

4) 去雄,不同植株異花授粉后套袋,檢測雜交是否親和;

5) 去雄,套40目尼龍網紗袋,檢測其結實率是否受傳粉者限制;

6) 去雄,套袋,檢測是否存在無融合生殖。

1.3 數據分析

使用Excel軟件對試驗數據進行處理和統計分析。結果以平均值±標準誤差表示。

2 結果與分析

2.1 花部形態與開花習性

通過花期物候觀察,麗萼熊巴掌的花期為4月中旬至5月中旬。3月下旬花芽開始萌動,4月中旬開花,4月下旬到達盛花期,5月中旬為末花期(表1)。在實際觀察過程中,發現麗萼熊巴掌的開花進程受光照影響較大,向陽區域的植株花期普遍較背陰區域植株花期提早2～4 d。

麗萼熊巴掌傘形花序頂生,花冠紫色,廣卵形,具緣毛。單花直徑(2.182±0.161)cm,雌蕊長(1.369±0.091)cm,花瓣數多為四、稀三瓣或五瓣;雄蕊數與花瓣數對應,多為八、稀六或十;花絲白色,長(0.709±0.079)cm;花藥紫紅色,長(0.807±0.059)cm,柱頭淡粉色或淡紫色;花萼紫紅色或透明,萼筒長(0.685±0.059)cm;花梗紫紅色,長(1.009±0.145)cm。葉片紙質或近膜質,基部心形。葉片廣卵形或近橢圓形,具疏緣毛。葉背常紫紅色,葉柄具槽,槽兩側被微柔毛。單株具(5±2)個花序,單花序(25±9)朵花。單花序花期持續(18.6±3.1)d,單花花期1～2 d。

根據麗萼熊巴掌花的發育進程,將花期分為以下5個時期:

1) 花蕾期(圖1 A):花被苞片覆蓋,花被片突破苞片顯露紫紅色,萼片綠色,尖端呈紫紅色,花萼白色或紫紅色,該時期持續17～25 d;

2) 松蕾期(圖1 B、C):柱頭已經從即將開放的花朵中伸出,分泌少許粘液,花瓣折疊,按逆時針方向排列,花內雄蕊彎折,這一時期持續2～3 d;

3) 盛花期(圖1 D、E):花朵完全盛放,花瓣紫色,雄蕊呈環形空間排列,雌蕊位置保持松蕾期伸出位置不變,花藥開裂,盛開時間1～2 d;

4) 末花期(圖1 F、G):花瓣開始閉合,雌蕊位置不變,雄蕊往中間聚合,雄蕊頂部花藥呈褐色,這一時期持續1～2 d;

5) 謝花期(圖1 H):花瓣開始萎蔫,隨后花瓣和雄蕊開始依次凋落,僅雌蕊宿存,雌蕊柱頭由淡粉色變為褐色,宿存1～3 d后也開始凋落。

注:A為花蕾期;B,C為松蕾期;D,E為盛花期;F,G為末花期;H為謝花期。箭頭指示為柱頭。圖1 麗萼熊巴掌花的開放進程Fig.1 Flowering process of P. longiradiosa var. pulchella

通過花蜜檢測結果發現,麗萼熊巴掌的花不分泌花蜜。

2.2 雜交指數

麗萼熊巴掌花直徑(2.182±0.161)cm,花兩性,雌蕊比雄蕊先熟,柱頭與花藥空間分離。根據Dafnia[10]提出的標準,麗萼熊巴掌雜交指數值為4(表2),該物種的繁育系統為異交,部分自交親和且需要傳粉者。

表2 麗萼熊巴掌雜交指數測定Table 2 Determination for out-crossing index of P. longiradiosa var. pulchella

2.3 花粉胚珠比

麗萼熊巴掌花具雄蕊8個,單花藥平均含花粉(177 778±11 111)粒,單花平均花粉粒數(1 422 222±88 889)粒,單花胚珠數平均為(294±45)個,花粉胚珠比值為4 977±895,依據Cruden[11]提出的標準,麗萼熊巴掌的繁育系統屬于專性異交(表3)。

表3 麗萼熊巴掌花粉胚珠比Table 3 Pollen-ovule ratios of P. longiradiosa var. pulchella

2.4 花粉與柱頭的生物學特性

2.4.1柱頭形態結構與柱頭可授性

麗萼熊巴掌花柱長(1.36±0.09)cm,柱頭頂端呈圓形,淡粉色至淡紫色,直徑約0.3 mm,柱頭花粉接受面密布透明狀乳突,表面分泌粘液(圖2),這樣的結構能使它更容易接受花粉。松蕾期柱頭乳突不明顯,而盛花期、末花期和謝花期柱頭均能看到較為明顯乳突,末花期和謝花期柱頭有明顯褐色且謝花期柱頭褐色較深(圖2 C、D),將4個時期的柱頭浸泡至聯苯胺-過氧化氫溶液中,柱頭周圍均有氣泡產生(圖3)。其中,松蕾期柱頭產生的氣泡較少,其余3個時期均產生大量氣泡,說明4個時期的柱頭都具有授粉活性,松蕾期柱頭授粉活性最低,盛花期授粉活性最高。

注:A為松蕾期;B為盛花期;C為末花期;D為謝花期。下同。圖2 麗萼熊巴掌4個時期柱頭形態對比Fig.2 Comparison for stigma morphology of P. longiradiosa var. pulchella in four periods

2.4.2花粉形態結構與花粉活力

麗萼熊巴掌花粉呈橢圓形或卵圓形,花粉粒大小(16.99±1.46)μm×(17.95±1.27)μm,P/E比值為1.06±0.06。通過3種染色法(I2-KI、MTT、TTC)檢測盛花期、末花期的花粉活性,發現花粉對MTT染色法反應明顯,有活力的花粉明顯變為藍紫色。其余2種染色法反應不明顯,應用I2-KI染色法所有花粉均被染為黃褐色,無法判斷花粉活性。使用TTC染色法的花粉幾乎不上色,難以分辨花粉活力。綜上,最終選擇MTT染色法測定麗萼熊巴掌的花粉活力。

圖3 麗萼熊巴掌的柱頭可授性Fig.3 Stigma receptivity of P. longiradiosa var. pulchella

各時期取5個樣本,統計其花粉活力。由圖4可知,盛花期花粉活力均高于95%,平均為(95.97±0.56)%,末花期平均花粉活力(60.85±3.51)%,花粉活性最低為58%。盛花期大多數花粉被染成深紫色,

圖4 盛花期與末花期花粉活力對比Fig.4 Comparison of pollen activity between flowering and terminal stage

少數為淡紫色,極少部分不染色(圖5 A),末花期花粉大部分被染成淡紫色或不染色,少部分為深紫色(圖5 B),說明末花期花粉仍具有活力,只是相較于盛花期花粉活性較低。

2.5 套袋實驗結果

由表4可知,麗萼熊巴掌人工異花授粉的坐果率為30%,高于人工自花授粉的坐果率(8%),說明該物種具有較強的異花傳粉傾向,同時證明其繁育系統主要為異交型,存在部分自交親和。直接套袋處理不結實,說明麗萼熊巴掌的自然自交需要傳粉者,不存在主動自交現象。去雄直接套袋的坐果率為0,表明麗萼熊巴掌不存在無融合生殖。在自然授粉條件下,麗萼熊巴掌坐果率為12%,低于人工異花授粉坐果率,說明麗萼熊巴掌傳粉活動受傳粉者限制;去雄直接套網紗袋坐果率僅2%,表明其存在風媒傳粉現象,但主要自然傳粉方式還是通過昆蟲訪花。

表4 麗萼熊巴掌套袋實驗結果Table 4 The test result of emasculation of P. longiradiosa var. pulchella

3 討 論

3.1 麗萼熊巴掌的開花動態及花部形態

花作為被子植物的繁殖器官,為保證其物種的繁殖與延續,會根據環境變化形成多樣的花部活動[12]。麗萼熊巴掌柱頭成熟與花藥開裂時間存在差異,柱頭成熟在前,花藥開裂在后,這樣的選擇既能有效避免自

花傳粉,又能提高其傳粉的準確性,延長異花授粉時間。麗萼熊巴掌松蕾期(圖1 B、C)柱頭從花朵中伸出,分泌少許粘液,花瓣折疊,按逆時針方向排列,花內雄蕊彎折,2～3 d后達到盛花期(圖1 D、E),此時花瓣完全展開,雄蕊呈環形空間排列,雌蕊位置保持松蕾期伸出位置不變,花藥開裂,持續1～2 d后到達末花期(圖1 F、G),此時花瓣開始閉合,雌蕊位置不變,雄蕊往中間聚合,這一時期持續1～2 d,這表明其花部器官在空間上呈現動態式雌雄異位[13-14],兩者結合為異花授粉提供了可能。柱頭主要分為可產生溢出物黏著花粉的濕型柱頭和不產生溢出物的干型柱頭[15-16]。通過觀察可知麗萼熊巴掌為濕型柱頭,柱頭表面有許多帶粘液乳突,可有效黏著花粉,并且麗萼熊巴掌直至開花末期,柱頭仍具有可授性,而同科植物枝毛野牡丹、毛菍的柱頭在花后才具有活性[6-7],多樣的傳粉機制和較長的傳粉時間可為麗萼熊巴掌繁殖提供多種保障措施。

值得注意的是檢測麗萼熊巴掌花粉活力時,使用I2-KI法所有花粉均被染為黃褐色,使用TTC法花粉幾乎不上色,均不能判斷花粉活性。I2-KI法無法測定麗萼熊巴掌的花粉生活力,說明其花粉中淀粉含量較低或不含淀粉。同科植物毛菍使用TTC法可將具有活性的花粉染為紅色[6],表明同科植物的不同種之間花粉活力測定方式存在差異。使用MTT法測定麗萼熊巴掌花粉活性,有活性的花粉均被染成藍紫色,根據其上色的深淺能夠清晰地分辨花粉的活力強弱(圖5)。因此,建議采用MTT染色法測定麗萼熊巴掌花粉活力。

3.2 麗萼熊巴掌的繁育系統

綜合雜交指數、套袋實驗結果發現,麗萼熊巴掌的繁育系統屬異交,部分自交親和且需要傳粉者,這一研究結果還存在于同科植物細葉野牡丹、白花野牡丹、毛菍、枝毛野牡丹中。而花粉胚珠比值顯示麗萼熊巴掌的繁育系統屬于專性異交,這種根據花粉胚珠比值得出的繁育系統與實際不符并不是個例,如喜樹(Camptothecaacuminata)[17]、大花黃牡丹(Paeonialudlowii)[18]等也有類似的現象,故植物繁育系統的確定還需綜合雜交指數與套袋實驗結果綜合考慮。

自然界中,并非所有花都可授粉、坐果并產生種子,授粉成功性的大小可直接影響坐果率的高低,植物坐果率受花粉和資源限制[19]。套袋實驗中,麗萼熊巴掌的人工異花授粉坐果率高于人工自花授粉,自然授粉坐果率略高于人工自花授粉坐果率,說明其自花授粉親和性較低;人工異花授粉坐果率高于自然授粉坐果率,說明其存在花粉限制,這可能與昆蟲傳粉頻率低有關。同時,研究中發現,盛花期開花植株坐果率高于始花期和末花期,說明麗萼熊巴掌還存在著資源限制,始花期和末花期的花序無法獲得足夠的資源而落花落果嚴重,從而較難達到生殖成功。查閱相關標本及實地調查發現,原生生境麗萼熊巴掌坐果率高于引種地,結合試驗地氣候推測,麗萼熊巴掌花期引種地桂林正處于雨季,連續性降雨影響昆蟲訪花,同時影響花粉的生命力,導致柱頭部分粘液流失,后續研究將通過調節降雨變量,探究是否受這一因素影響。其引種結實率低下的原因除了非生物因素(陰雨天氣)外,是否還存在群落環境(傳粉者)制約,即其野外生境是否存在該種專性傳粉昆蟲,還有待進一步研究。

3.3 麗萼熊巴掌觀花應用前景

麗萼熊巴掌開花進程觀察顯示,麗萼熊巴掌在花蕾期具有較高的觀賞性,花蕾呈玫瑰紅色,或白色頂部點綴一些突出的紫紅色花瓣(圖1 A),可持續約1個月,加上花期,整個觀賞期可達2個月。麗萼熊巴掌花期4—5月,而同科其他已開發的園林花卉植物如野牡丹、細葉野牡丹,地菍的花期多為6—8月[20]。野牡丹科植物花部觀賞價值很高,很適合用于建立專類觀賞植物區,麗萼熊巴掌花期與已開發的同科植物花期不同,正好可延長整個野牡丹科觀賞植物的觀花期。麗萼熊巴掌高30～100 cm,花朵十分美麗,喜陰,但需要一定的光照,水邊、闊葉林下長勢及花數明顯優于蔭蔽林下,自然條件下,背陰區域的麗萼熊巴掌開花較晚。在實際園林應用中可將其種植于湖邊或溪邊巖石旁與水景相映成趣,亦可將其配植于林下,喬、灌、草搭配種植。我國本土種的花境植物應用較少,開發麗萼熊巴掌花卉資源,對其開花物候及繁育系統進行研究,并將其應用于城市環境美化及盆栽欣賞,對于廣西乃至我國建立特色觀賞花卉植物資源具有重要意義。