豌豆種子發育進程中蛋白質組分的動態變化

樂 帥, 郭 瑞, 陳 高, 屈雪華, 陳禪友

(江漢大學生命科學學院/湖北省豆類(蔬菜)植物工程技術研究中心, 武漢 430056)

豌豆(PisumsativumL.)又叫青豆、寒豆、荷蘭豆,為豆科、蝶形花亞科、豌豆屬一年生或越年生的冷涼性作物[1],根據食用目的可分為糧用豌豆、食用嫩豆粒或食嫩莢的菜用豌豆[2]。豌豆作為主要的豆類作物之一遍布全世界,有著悠久的種植歷史,可以作為蔬菜、飼料、甚至是主糧[3-4]。豌豆一般越冬栽培,錯開農時,能夠提高土地利用率,對土壤要求不高,并且豆科作物的固氮作用能夠改善土地營養狀況[5-6]。豌豆蛋白質含量高,含有滿足人體所需要的所有必需氨基酸、微量礦物質及維生素[7]。

豌豆品種繁多,早期豌豆品種鑒定、種子檢驗都是使用室內檢驗和田間檢驗的方法[8],檢驗誤差大。一般來說,豌豆種子含有20%～25%的蛋白質,40%～50%的淀粉和10%～20%的纖維[9],種子貯藏蛋白一般是在種子發育后期大量合成和積累,根據溶解特性可分為水溶蛋白、鹽溶蛋白、醇溶蛋白和堿溶蛋白[10-11]。分子生物學研究表明,品種之間的差異主要取決于遺傳物質,蛋白質是基因表達的產物,可作為品種鑒定的依據[12]。種子貯藏蛋白具有遺傳穩定性,已被作為遺傳標記廣泛應用于材料間遺傳多樣性分析、品種鑒定、遺傳資源保存和育種相關的植物馴化、植物改良育種等方面[13]。SDS-PAGE種子蛋白質電泳可以根據蛋白質的種類、結構及大小來對蛋白質組分進行分離并成為一種解決植物分類、進化問題、品種和變種的鑒定、種質特征分析的有效工具[14-16]。

前人相關的研究主要涉及種子蛋白電泳對品種的鑒定[17-18]、遺傳多樣性的分析[19-20]以及種子萌發過程中蛋白變化[21-22];朱新產和趙文明[23-24]以陜西商縣白豌豆為研究對象,采用豌豆開花后的天數來劃分種子發育期,利用SDS-PAGE蛋白質電泳來探究種子發育過程中貯藏蛋白的生物合成,發現種子發育過程中貯藏蛋白的積累順序依次是豌豆球蛋白、豆球蛋白、伴豌豆球蛋白。孫雁等[25]以25個豌豆品種為實驗材料,分別提取水溶、鹽溶、醇溶、堿溶蛋白進行SDS-PAGE凝膠電泳,發現水溶、鹽溶、堿溶3種蛋白在品種間存在不同程度的譜帶差異,可以用于品種鑒定。鄭蕊等[26]利用雙向電泳研究了大豆N 2899開花后種子不同發育過程中蛋白質的差異表達,發現有些蛋白質在整個發育過程中都出現,有些蛋白質只出現在發育早期或成熟的種子中,這些蛋白主要參與種子的成熟。耿曉宇等[27]以甘藍型油菜品種為材料,從開花后固定天數取樣測定種子發育的蛋白質含量,發現種子發育過程中的蛋白質積累為較復雜的三峰或四峰曲線,高蛋白質材料在開花后60 d左右蛋白質含量極顯著高于低蛋白質材料,且在此時達到最大值。蔣冬花等[28]發現,水稻種子貯藏蛋白中谷蛋白和醇溶蛋白是最主要的蛋白,發現醇溶蛋白與谷蛋白電泳圖譜在不同水稻品系間都存在比較明顯的差異。

本實驗以豌豆的形態學特征進行種子發育階段劃分,對供試豌豆不同種子生長時期的4種可溶性蛋白含量進行測定,挖掘豌豆種子發育過程中各蛋白組分含量變化規律;同時將供試豌豆品種不同時期的蛋白質組分進行SDS-PAGE凝膠電泳,從生成電泳圖譜查找特異性條帶,找到具有種子特異性的條帶所對應的發育時期,探究能否在種子尚未完全成熟的時候判斷種子之間的差異,為豌豆種質鑒定提供理論和技術依據。

圖1 豌豆豆莢發育進程(WD-021)Fig.1 Developmental process of pea pods (WD-021)

1 材料與方法

1.1 材 料

供試材料為湖北省豆類(蔬菜)植物工程技術研究中心提供的8個豌豆品種,于2021年11月1日在武漢豆博士農業科技生態園(湖北省武漢市漢南區湘口鎮,113°25′E,30°11′N)按小區進行播種,土壤肥力均衡,采用常規的栽培種植模式,每個品種3次重復。品種相關信息如表1所示。

表1 8個豌豆品種形態學特征Table 1 Morphological characteristics of eight pea cultivars

因不同豌豆品種的成熟期、類型以及對環境表現不同,所以不適合用發育天數對豌豆種子發育期進行劃分,而選擇豌豆的形態學特征劃分種子發育階段,豆類種子成熟階段[29]可分為綠熟期、黃熟期、完熟期和枯熟期,本研究進行了相應調整,將豌豆種子發育時期分為幼嫩期、嫩莢期、青熟期、黃熟期、完熟期等5個形態學時期進行研究,以WD-021為例,各階段形態如圖1所示。

1.2 方 法

1.2.1不同溶解性的蛋白質組分提取

根據蛋白質的溶解性質,參考Osboren蛋白分類法[30],利用蒸餾水、稀鹽、乙醇和稀堿溶液連續提取豌豆種子中的水溶蛋白、鹽溶蛋白、醇溶蛋白及堿溶蛋白組分。分別取幼嫩期到完熟期豌豆種子,利用研缽或磨粉機粉碎并裝入離心管中超聲波清浸提,取出后離心取上清液定容,最終得到的溶液為水溶蛋白提取液;提取過水溶蛋白的沉淀依次加入5% NaCl溶液、75%乙醇、0.1 mol/L NaOH,重復水溶蛋白提取步驟得到鹽溶蛋白提取液、醇溶蛋白提取液和堿溶蛋白提取液。

1.2.2蛋白質含量測定

參考考馬斯亮藍G-250法測定蛋白質含量[31],以牛血清白蛋白溶液作為測定的蛋白質標樣母液,建立回歸方程,測定稀釋后的蛋白質溶液及母液的吸光度值,以y為吸光度,x為蛋白質含量。用同樣的方法測定提取后的豌豆蛋白提取液吸光值,根據回歸方程計算出蛋白質含量,結果為每毫克牛血清白蛋白當量每克豌豆樣品鮮重。

1.2.3SDS-PAGE蛋白電泳

按照SDS-PAGE法[32]對提取的蛋白進行蛋白電泳,取40 μL蛋白質提取液到1.5 mL離心管,加入10 μL 5×上樣緩沖液(1.25 mL Tris-HCl+0.5 g SDS+25 mg溴酚藍+2.5 mL 50%甘油+250 μL β-巰基乙醇加蒸餾水定容至5 mL)混勻后沸水浴10 min,待冷卻后取15 μL點樣,Marker點樣3 μL,采用12%分離膠,5%濃縮膠;凝膠厚度0.75 mm,調節電壓恒定至80 V運行40 min,待Marker跑出條帶,溴酚藍濃縮為一條直線時調節電壓120 V運行80 min,直到溴酚藍指示劑到凝膠底部時停止電泳。取出凝膠放入考馬斯亮藍R-250溶液(2 g考馬斯亮藍 R-250+250 mL異丙醇+100 mL冰醋酸加蒸餾水定容至1 000 mL)中染色40 min,使用脫色液(100 mL冰醋酸+50 mL無水乙醇加蒸餾水定容至1 000 mL)進行脫色,待條帶清晰后進行數據讀取。

1.2.4數據統計分析

利用WPS軟件對蛋白含量的數據進行分類、整合,生成相應圖表;利用Quantity one-4.6.2軟件對水溶蛋白、鹽溶蛋白和堿溶蛋白分離出的電泳譜帶進行自動讀取,將豌豆種子各蛋白亞基信息以表格的形式呈現。每個材料有對應蛋白分子量的賦值為1,沒有的賦值為0,建立0和1的數據矩陣。

2 結果與分析

2.1 蛋白質含量

各品種種子不同發育時期的蛋白質組分含量變化如圖2、圖3、圖4所示。

圖2 8個豌豆品種在5個種子發育時期水溶蛋白含量Fig.2 Albumin protein content in eight pea cultivars at five seed developmental stages

圖3 8個豌豆品種在5個種子發育時期鹽溶蛋白含量Fig.3 Salt-soluble protein content in eight pea cultivars at five seed developmental stages

幼嫩期各蛋白組分的占比差距不大,嫩莢期開始水溶蛋白占大多數,可知水溶蛋白從嫩莢期開始加速積累。在青熟期以前,鹽溶蛋白與堿溶蛋白差異不顯著,青熟期以后,鹽溶蛋白開始加速積累。堿溶蛋白品種間變化的一致性很強,在黃熟期以前一直趨于相對穩定狀態,黃熟期以后才開始大量積累并最終超過鹽溶蛋白的含量。除醇溶蛋白外,其他3種蛋白質組分含量隨著種子的成熟而逐漸增加,并在完熟期達到最大值,完熟期蛋白質組分含量差異最大。不同豌豆品種的蛋白質組分含量差異極顯著(p<0.01),種子發育時期各蛋白組分中,WD-021和WD-123總的可溶性蛋白均相對較高。豌豆醇溶蛋白含量如表2所示,除幼嫩期與嫩莢期含量極少外,其余時期幾乎檢測不到醇溶蛋白,可見醇溶蛋白在種子形成之初就存在,在種子生長發育過程中并未明顯增加且在嫩莢期之后消失。

表2 8個豌豆品種在5個種子發育時期醇溶蛋白質組分含量Table 2 Gliadin content in eight pea cultivars at five seed developmental stages

如表3所示,在豌豆種子生長發育過程中,不同蛋白質組分含量均有差異,水溶蛋白含量始終高于其他3種蛋白。

表3 豌豆種子5個發育時期蛋白組分含量方差分析Table 3 Variance analysis of protein fraction contents among five developmental stages at pea seeds

表4 商品莢時期8個品種3種蛋白質組分含量Table 4 Protein fractions contents of three from eight cultivars at the commercial pod stage

菜用豌豆的食用時期主要在商品莢時期,因此商品莢時期豌豆蛋白組分含量對消費者具有一定的營養參考價值。商品莢采收時期對應甜豌豆種子發育的青熟期以及荷蘭豆種子發育的嫩莢期,供試材料各蛋白的含量如表4所示,水溶蛋白含量占可溶性蛋白的絕大部分,甜豌豆品種各蛋白組分含量均明顯高于荷蘭豆品種,WD-021與WD-123的水溶蛋白顯著(p<0.05)高于其他豌豆品種,此表可作為不同豌豆品種蛋白質營養成分攝入的參考。

2.2 幼嫩期到黃熟期蛋白凝膠電泳

通常能夠進行品種鑒定的蛋白譜帶是能夠與其他品種譜帶進行區分并且穩定遺傳的譜帶。通過不同豌豆品種幼嫩期及完熟期各蛋白亞基信息,以表格的形式呈現0和1的數據矩陣,對符合條件的蛋白譜帶進行查找,WD-001和WD-005在完熟期以前均不能通過電泳譜帶進行區分。WD-008黃熟期水溶蛋白的14、24、31號譜帶,鹽溶蛋白的10、11、16、22、40號譜帶,堿溶蛋白的5、9、14、21、30、31、33、40、42號譜帶能夠將WD-008進行區分。WD-021青熟期水溶蛋白的20、21、27、37、39、40、44號譜帶,鹽溶蛋白的20、27、30、40號譜帶,堿溶蛋白的5、8、9、20、21、28、30、40號譜帶能將WD-021進行區分;黃熟期水溶蛋白的9、14、20、31、40號譜帶,鹽溶蛋白的10、11、16、23、27、40號譜帶能將WD-021進行區分。WD-051青熟期鹽溶蛋白的30號譜帶,堿溶蛋白的33、40、42號譜帶能將WD-051進行區分。WD-085青熟期水溶蛋白的27、31、37、44號譜帶,鹽溶蛋白的20、27、30、40號譜帶,堿溶蛋白的5、8、20、21、40號譜帶能將WD-085進行區分;黃熟期水溶蛋白的9、10、11、12、31、40號譜帶,鹽溶蛋白的10、27、34號譜帶,堿溶蛋白的5、9、21、27、29、40號譜帶能將WD-085進行區分。WD-118青熟期水溶蛋白的20、21、27、33、37、39號譜帶,鹽溶蛋白20、23、27、30號譜帶,堿溶蛋白的5、8、9、14、20、21、22、30、31、37、39、40、42號譜帶能將WD-118進行區分;黃熟期水溶蛋白的9、10、11、12、20、22、24、33、40號譜帶,鹽溶蛋白的10、11、22、23、27、40號譜帶,堿溶蛋白的5、9、10、14、22、24、30、31、39、42號譜帶能將WD-118進行區分。WD-123黃熟期水溶蛋白的9、11、20、24、31、40號譜帶,鹽溶蛋白的10、23、40號譜帶,堿溶蛋白的5、9、24、30、33、39、42號譜帶能將WD-123進行區分。所有品種均無法在幼嫩期和嫩莢期進行區分,因此該時期的種子蛋白僅具備營養特性;青熟期和黃熟期部分品種能夠通過電泳譜帶進行區分,所以該時期是種子蛋白從營養屬性開始轉變為兼備種質特異性的過渡期,但還達不到區分所有豌豆品種的條件。如圖5所示,以WD-008為例在不同時期不同組分的蛋白電泳,也可以看出3種蛋白在幼嫩期和嫩莢期的電泳譜帶比較離散不清晰,青熟期之后蛋白條帶相對清晰并且譜帶變化波動較小。

注:以WD-008為例從左到右依次為水溶蛋白、鹽溶蛋白、堿溶蛋白;M為蛋白質Marker,含有10條譜帶,相對分子量分別為180 kDa、130 kDa、95 kDa、70 kDa、55 kDa、43 kDa、33 kDa、25 kDa、17 kDa、10 kDa;A～E依次為幼嫩期、嫩莢期、青熟期、黃熟期、完熟期。圖5 豌豆種子5個發育時期3種蛋白組分電泳圖(WD-008)Fig.5 Electrophoretic diagram of three proteins at five seed developmental stages (WD-008)

2.3 完熟期蛋白凝膠電泳

豌豆種子完熟期水溶蛋白分離的各亞基凝膠電泳如圖6所示,其相對分子量在10.62～95.55 kDa之間,主要分布區間在66.53～95.55 kDa、24.11～51.56 kDa以及13.13～19.17 kDa。完熟期種子水溶蛋白總共有31條譜帶,WD-118譜帶數量最多為27條,WD-008分離出的譜帶數量最少為20條。其中譜帶1、4、5、9、10、14、16、17、18、20、21、25、28號在8個豌豆種子材料中都有出現,為保守條帶,共14條,比率為45.16%。

豌豆種子完熟期鹽溶蛋白分離的各亞基凝膠電泳如圖7所示,其相對分子量在16.78～95.55 kDa之間,主要分布在21.92～49.84 kDa和16.78～19.72 kDa范圍中,總共有24條譜帶,WD-005與WD-008有24條譜帶數量最多,WD-001的譜帶條數為17,數量最少。其中譜帶2、3、4、6、9、11、12、14、16、18、19、20、21、24、25號在8個豌豆種子材料中都有出現,共15條保守帶,保守條帶所占比率為62.50%,由此可見和水溶蛋白相比,鹽溶蛋白的保守性更強。

豌豆種子完熟期堿溶蛋白分離的各亞基凝膠電泳如圖8所示,其各亞基相對分子量在15.69～95.55 kDa之間,主要分布在73.58～95.55 kDa、22.36～49.84 kDa以及15.69～19.12 kDa區域,共有28條譜帶,WD-118譜帶數量最多,為26條,WD-001的譜帶數量最少,為16條,其中2、8、9、12、14、15、19、20、21、26、27、28號譜帶在供試材料中均有出現,為保守帶,共12條,其保守帶所占比率為42.86%。

注:M為蛋白質Marker,含有10條譜帶,相對分子量分別為180 kDa、130 kDa、95 kDa、70 kDa、55 kDa、43 kDa、33 kDa、25 kDa、17 kDa、10 kDa;1～8分別對應8個豌豆品種,依次為WD-001、WD-005、WD-008、WD-021、WD-051、WD-085、WD-118、WD-123。下同。圖6 8個豌豆品種種子完熟期水溶蛋白電泳圖Fig.6 Electrophoretic diagram of album at the full ripen stage of seed in eight pea cultivars

圖7 8個豌豆品種種子完熟期鹽溶蛋白電泳圖Fig.7 Electrophoretic diagram of salt-soluble protein at the full ripen stage of seed in eight pea cultivars

圖8 8個豌豆品種種子完熟期堿溶蛋白電泳圖Fig.8 Electrophoretic diagram of alkali-soluble protein at the full ripen stage of seed in eight pea cultivars

根據完熟期不同蛋白組分的電泳譜帶可以得出鹽溶蛋白的保守性最強,其次是水溶蛋白,最后是堿溶蛋白。完熟期各豌豆品種均能結合水溶蛋白6、7、10、11、12、13、20、21、22、24、33、34、41、43、45號譜帶,鹽溶蛋白5、11、13、14、16、22、24、27、38、39號譜帶,堿溶蛋白5、6、9、10、12、14、21、22、34、28、29、30、36、39號譜帶進行品種區分。其中具備代表性的譜帶有水溶蛋白中7號譜帶是WD-051的特有帶,如圖6的5號泳道箭頭所示;29、45號譜帶是WD-008的特有帶,如圖6的3號泳道箭頭所示;鹽溶蛋白中13號譜帶是WD-051的特有帶,如圖7的5號泳道箭頭所示。鹽溶蛋白中的5號譜帶只有WD-001沒有,如圖7方框所示;堿溶蛋白中5、30號譜帶只有WD-001沒有,圖8的方框所示。在完熟期中各蛋白組分已經積累至相對穩定狀態,并且可以通過電泳譜帶進行品種區分,因此豌豆種子生長發育階段到完熟期具備種質特異性。

3 討 論

3.1 種子蛋白質變化的時序性

豌豆種子蛋白的發育是一個動態變化的過程,盡管在豌豆種子發育時期不同豌豆品種的蛋白組分含量有差異,但是在變化趨勢上是一致的,到完熟期達到最大值;完熟期種子各蛋白組分含量由多到少依次為水溶蛋白、堿溶蛋白、鹽溶蛋白,這與劉珍珍[33]研究蠶豆清蛋白和谷蛋白是相對含量最多的組分的結果相同。水溶、鹽溶、堿溶蛋白分別在嫩莢期、青熟期、黃熟期之后開始加速積累直至完熟期,可以看出這三種蛋白才是主要的豌豆種子貯藏蛋白,而醇溶蛋白在種子發育早期含量極少并在后期消失,這一結果與孫雁等[25]的研究結果有相似之處。從醇溶蛋白變化規律推出醇溶蛋白是僅供植物生長發育前期所需要的成分,而在生長發育后期不需要,因而就沒有醇溶蛋白的表達,也說明醇溶蛋白既不是為人類提供的營養物質更不是貯藏蛋白的組成部分。在商品莢時期,甜豌豆品種可溶性蛋白含量顯著高于荷蘭豆品種,且甜豌豆品種WD-021和WD-123顯著高于其他品種,因此有利于通過這兩個品種的栽培來獲取優質蛋白營養。

3.2 蛋白質電泳圖譜信息及其利用

對豌豆種子不同生長發育時期蛋白電泳條帶比較分析可知,幼嫩期到嫩莢期豌豆種子蛋白電泳譜帶具有同質性。青熟期和黃熟期只有部分品種間具有差異,說明該時期是種子蛋白從營養屬性轉變為兼備種質特異性的重要轉換期且以營養屬性為主。在探究種子未完全成熟時判斷種子之間的差異問題上,雖然不能夠準確地進行品種區分判斷,但是在接近完熟期時的蛋白電泳圖譜能夠提供一些信息依據。在完熟期豌豆蛋白積累相對穩定,并且能夠結合3種蛋白組分信息區分不同品種,完熟期的種子蛋白兼具營養和遺傳的雙重特性。完熟期各蛋白組分的保守性強弱依次為鹽溶蛋白、水溶蛋白、堿溶蛋白,因此通過以上結果可以優先用完熟期堿溶蛋白和水溶蛋白的電泳譜帶對品種進行區分。隨著豌豆種子的發育蛋白譜帶的不斷變化,生長早期分布的有些譜帶在后期消失,同時也伴隨著一些譜帶的生成,直至完熟期電泳譜帶趨于穩定,說明早期的種子蛋白優先滿足生長發育的需要,后期由于基因的調控生成一些有別于其他品種的特異性譜帶,具備種質特異性。