箭葉淫羊藿種子質量檢驗方法研究

侯文川, 楊林林, 初雷霞, 董 寧, 杜真輝, 鐘 華, 董誠明

(1.河南中醫藥大學藥學院, 鄭州 450046;2.河南省道地藥材生態種植工程技術研究中心, 鄭州 450046;3.河南省平輿縣農業農村局, 河南 平輿 463400)

箭葉淫羊藿[Epimediumsagittatum(Sieb. et Zucc.)Maxim.]是小檗科淫羊藿屬多年生草本植物,主要分布于湖南、安徽、河南等省,以葉入藥,為我國傳統中藥材淫羊藿的基原之一[1]。淫羊藿具有抗炎、抗腫瘤、抗骨質疏松等多種藥理作用[2],在醫藥、保健等領域應用廣泛[3],是最具開發潛力和市場潛力的中藥之一。隨著市場需求量的不斷增大,箭葉淫羊藿人工栽培面積逐年攀升。目前在河南省豫南地區已經形成較大規模人工種植基地,其中駐馬店市種植面積為266.67 hm2,年產量在400 t以上。

種子是中藥材生產的源頭,優良的種子是生產優質高產中藥材的先決條件[4],開展種子質量檢驗研究不僅是保證中藥材質量安全穩定的前提,更是規范化生產急需解決的重要問題[5-7]。箭葉淫羊藿繁殖方式主要包括根莖分蘗和種子繁殖[8]。因箭葉淫羊藿種子結實率低,具有休眠特性[9],所以實際生產多以根莖分蘗為主,但長期的無性繁殖會導致種性退化,病蟲害頻發,因此種子繁殖技術研究迫在眉睫。研究表明淫羊藿屬植物種子普遍存在休眠現象,究其原因是胚形態后熟和發芽抑制物的存在,而低溫和激素處理能促進胚成熟、解除休眠、加快萌發[10-12]。目前關于箭葉淫羊藿種子研究主要集中在促進萌發和提高結實率等方面,尚未見到箭葉淫羊藿種子質量檢驗方法的研究。

本試驗參考農作物種子質量檢驗規程,從含水量、生活力、發芽率等方面進行種子質量檢驗方法研究,為箭葉淫羊藿種子質量標準的制定提供依據,為擴大種植生產和提高種子的流通奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試材料為河南省駐馬店市平輿縣箭葉淫羊藿規范化種植基地提供的當年種子,經河南中醫藥大學董誠明教授鑒定為箭葉淫羊藿(Epimediumsagittatum(Sieb. et Zucc.)Maxim.)種子。

1.2 儀器和試劑

RTOP-430 D智能人工氣候培養箱(浙江托普儀器有限公司);SMZ-171體視顯微鏡(麥克奧迪實業集團有限公司);LDZM-80 KCS型立式壓力蒸汽滅菌器(上海申安醫療器械廠)。

紅四氮唑(分析純)(上海山浦化工有限公司);赤霉素(國藥集團化學試劑有限公司);脫落酸(北京索萊寶科技有限公司);白菜種子(臨朐縣天和種業有限公司)。

2 方 法

2.1 種子真實性鑒定

隨機數取種子100粒,重復3次,逐一觀察種子的形狀、顏色、表面構造等特征,測量橫徑與縱徑,并縱剖成熟種子觀察、記錄,計算胚率。

2.2 千粒重測定

分別用百粒法、五百粒法及千粒法測定,具體操作如下:隨機取100、500、1 000粒凈種子,稱重,并分別重復8、6、3次,記錄重量。計算均值、標準差及變異系數。

2.3 含水量測定

隨機取2份種子,每份2.5 g,分別用低恒溫法[(105±2)℃]和高恒溫法[(130±2)℃]測定含水量。分別于1、2、3、4、5、6、7、8、16 h和1、2、3、4、5、6 h計算種子水分損失量,重復3次。

2.4 種皮透水性測定

隨機取100粒種子,稱定重量。置于蒸餾水中在25 ℃恒溫條件下,每隔1 h取出,用吸水紙吸干表面水分后,稱重,直至連續2次測定值接近恒重為止。重復3次,計算吸水率并繪制吸水曲線。

吸水率/%=[(W1-W)/W]×100%,式中,W1為吸水后重量,W為吸水前重量。

2.5 生活力測定

采用TTC染色法,用pH值為6.5～7.5的緩沖液分別配置質量分數為0.1%、0.5%、1.0%、1.5%的TTC溶液,避光保存。種子在蒸餾水中浸泡8 h后沿種胚縱切,暴露胚,于25 ℃下分別染色1、2、3、4 h后,沖洗3～5次,觀察、記錄種子染色情況,計算生活率。重復3次,每次取種子100粒。

2.6 種子發芽最適條件

2.6.1適宜的發芽床

種子經75%酒精消毒2 min后,分別置于高溫滅菌過的沙床、紙床、脫脂棉3種發芽床上。在溫度設定為15 ℃培養90 d后轉至4 ℃的培養箱中發芽,每隔20 d觀察記錄種子霉變情況。3次重復,每次100粒種子。

2.6.2適宜的種子破眠溫度

取1 000粒種子拌于沙床中,置于4 ℃、15 ℃、25 ℃黑暗恒溫下進行試驗。每隔7 d攪拌翻動以保持通風并及時補充水分。每隔20 d,隨機抽取15粒種子,于體視解剖鏡下觀察不同層積階段種胚生長發育狀況,測定胚長、胚乳長,并計算胚率,3次重復。

胚率/%=(胚長/胚乳長)×100%。

2.6.3適宜的種子破眠激素處理

選擇外源激素赤霉素(GA3)和脫落酸(ABA),分別設置不同濃度:

GA3:100 mg/L、200 mg/L;

ABA:50 mg/L、100 mg/L。

圖1 箭葉淫羊藿種子表面構造Fig.1 Surface structure of E. sagittatum seeds

種子處理方式為浸泡8 h和種胚達到魚雷期后,以噴施形式保濕兩種。設計以蒸餾水處理為空白對照的9個處理組(表1),篩選最適破眠激素處理。

表1 種子破眠激素試驗設計Table 1 Seed sleep hormone trial design

2.6.4發芽實驗

破眠處理后種子出現出芽時,即可進行發芽實驗。在15 ℃恒溫光照培養箱中進行,光照12 h/d,每處理設3個重復,每個重復150粒種子,以伸出子葉為發芽標準,于第16天測定其發芽率。

3 結 果

3.1 種子基本形態

箭葉淫羊藿種子為腎狀長圓形,飽滿,外種皮呈現黑色有褶皺紋理,內種皮呈現紅褐色光亮不皺縮或皺縮,種臍明顯,種孔與種臍位于同一部位,形成倒生胚珠,具有瘤狀突起的種阜;種子的外部形態變化不大,經測定,箭葉淫羊藿種子橫徑為(1.643±0.169)mm,縱徑為(4.728±0.388)mm(圖1);種子成熟時,其胚率較低,為2.63%,存在明顯的形態休眠。

3.2 千粒重測定

由表2可知,3種方法變異系數均小于4.0%。將百粒法與五百粒法測定的種子重量換算為千粒重,結果分別為:(3.080 3±0.040 8)g、(3.036 6±0.096 9)g、(3.062 8±0.042 1)g。進行方差分析,3種方法不存在顯著差異,故可用百粒法測定千粒重。

表2 箭葉淫羊藿種子重量測定Table 2 Determination results of seed weight of E. sagittatum

3.3 含水量測定

箭葉淫羊藿種子含水量測定結果見表3,使用高恒溫法(130±2)℃和低恒溫法(105±2)℃烘干1 h后,水分含量無顯著變化。但高恒溫法所測得含水量較高,為31.07%,且連續5 h無變化,因此選擇高恒溫法(130±2)℃烘干1 h檢測箭葉淫羊藿種子含水量。

表3 低溫法、高溫法測定箭葉淫羊藿種子含水量Table 3 Water content determination of E. sagittatum seeds by low temperature method and high temperature method

3.4 種皮透水性測定

箭葉淫羊藿種子最終吸水率為58.52%。吸水過程可分為3個時期:快速吸水期(0～1 h)、緩慢吸水期(1～8 h)和近飽和期(8～10 h)(見圖2)。種子吸水結束后,種皮的顏色加深,種皮吸水而軟化。

表4 TTC法測定箭葉淫羊藿種子活力Table 4 Seed vigor of E. sagittatum determined by TTC method

3.5 生活力測定

由表4可知,染色1 h,各處理染色情況無顯著差異,表現為不能染色;0.1%的TTC溶液染色2 h、3 h、4 h,染色率顯著低于其他處理;染色2 h時0.5%、1.0%或1.5%濃度的TTC溶液染色情況無顯著差異,且染色均勻,染色效果好。考慮TTC溶液的毒性,箭葉淫羊藿種子生活力測定采用0.5%TTC溶液染色2 h即可(判定標準:有生活力的種子——胚和胚乳完全染色或胚完全染色,胚乳一半以上染色;無生活力的種子——胚未染色,胚乳染色或未染色;胚染色,胚乳一半或一半以上未染色)。

圖2 箭葉淫羊藿種子吸水曲線Fig. 2 Water absorption curve of E. sagittatum seeds

3.6 種子發芽最適條件

3.6.1適宜的發芽床

紙床,脫脂棉的發芽床上霉變種子從第9天開始出現并增多,在第60天霉變率達90%以上;而沙床的種子偶見霉變,因此以沙床進行種子處理實驗。

3.6.2適宜的溫度處理

由圖3可見,在恒溫處理140 d內,25 ℃處理下種子胚率顯著低于15 ℃及4 ℃處理;15 ℃處理下種子的胚率逐漸上升,20～40 d種子胚率上升較快,在80 d之前,胚率一直顯著高于其他處理;4 ℃處理下,種子在40 d后胚率快速增長,在140 d時胚率達到66.18%,發芽盒內種子已出芽。在140 d時對4 ℃處理種子進行發芽實驗,第16天其發芽率達到46.67%。

圖3 不同溫度恒溫處理下胚率變化Fig.3 Changes of embryo rate under different temperature and constant temperature treatment

3.6.3適宜的激素處理和發芽率

不同激素處理對箭葉淫羊藿種子破眠影響不同。在層積時間為80 d時,處理5、處理6、處理7發芽,且胚率最高,分別為70.69%、69.25%、79.34%,此時處理1(對照組)的胚率為53.88%。而處理8、處理9在層積100 d時發芽,處理1～處理4均在120 d發芽。

對發芽的處理組進行發芽試驗,統計發芽率。對9組處理按照綜合加權評分法進行計算,綜合評價。對層積時長及發芽率分別賦予0.5的權重系數,公式如下:

OD=(0.5×amax/ai+0.5×bi/bmax)×100,式中i指第i個實驗處理;max指該指標項下最大值。結果見表5。

由表5可以看出,處理7的OD值為1.22,綜合得分最高,層積時間為80 d,發芽率最高。因此箭葉淫羊藿種子發芽試驗的最適處理為:種子在蒸餾水中浸泡8 h,置沙床于4 ℃黑暗培養至魚雷期后,噴施200 mg/L GA3保濕。此處理80 d后種子出現發芽現象,96 d后發芽率為82.67%。

表5 綜合評價結果Table 5 Comprehensive evaluation results

4 討 論

種子作為基本生產資料,是中藥材安全生產的基礎。優質種子對中藥材提高產量、穩定質量起關鍵作用[13]。隨著種植規模的擴大,中藥材種子產業市場發展迅速,目前三七[14]、人參[15]等種子已發布國際標準,這對中藥材種子規范起到了引領作用,但與農作物種子標準化進程相比,中藥材種子質量標準控制還相對落后。箭葉淫羊藿與其他4種入藥典淫羊藿屬藥用植物,在湖北、河南等地已經形成較大規模種植基地,但尚未見過其種子質量檢驗方法的相關報道,這與其種子萌發困難、休眠特性及繁育周期長等特點有很大關系。

本研究發現,箭葉淫羊藿種子自然成熟時種胚尚未完全發育成熟,胚率較低,有明顯的形態生理休眠,這與田向榮等[9]的研究結果一致。除此之外,筆者對其種子內抑制物進行檢測發現,箭葉淫羊藿種子水提物及醇提物對白菜種子發芽率及根長均有抑制作用,且抑制作用隨濃度增加而增強,說明箭葉淫羊藿種子[9]與巫山淫羊藿[10-11]、朝鮮淫羊藿[12]種子相似,內含萌發抑制物。

種子的萌發和休眠是植物生命周期中具有重要農藝和生態意義的關鍵組成部分[16]。溫度是種子在發育過程中影響萌發的最重要因素[17],水分吸收是啟動種子萌發的關鍵觸發因素[18]。ABA和GA3是兩種主要的拮抗植物激素,兩種激素的合成和分解動態平衡是促進種子萌發和休眠平衡的關鍵,決定種子的萌發能力[19-20]。本試驗結果表明,4 ℃低溫層積和GA3激素處理種子,可將種子發芽時間縮短至80 d左右,96 d后發芽率為82.67%。

在種子檢驗的各項指標中,發芽率最為重要,可直接反映種子出苗率;千粒重和生活力可以間接反映種子的萌發潛力;種皮透水性直接反映種子是否存在種皮吸水障礙,含水量與千粒重、發芽率等密切相關。本研究設置以上指標,旨在對箭葉淫羊藿種子進行科學合理的檢驗,為淫羊藿屬藥用植物種子質量標準的制定提供方法和參考,為提高種子繁育專業化水平奠定基礎。