黑木耳黑色素的液體發酵培養及提取工藝研究

王小漫 柴新義 于士軍 向玉勇 孫星

摘要 為提高黑木耳黑色素的產量，以堿溶酸沉法對黑木耳液體發酵菌絲體中的黑色素進行提取，以黑色素得率為指標，采用單因素試驗和正交設計試驗，對黑木耳黑色素的液體發酵生產及提取工藝條件進行了研究。結果表明，黑木耳黑色素的最優液體發酵生產工藝條件為起始pH 5.5、25 ℃、培養9 d；最佳提取工藝條件為NaOH濃度2 mol/ L、料液比1∶40、浸提1.5 h。黑木耳黑色素得率可達1.55%。研究結果可為黑木耳工業化液體發酵生產黑色素提供重要的參考。

關鍵詞 黑木耳黑色素；液體發酵；黑色素得率；工藝條件優化

中圖分類號 Q939.96? ?文獻標識號 A

文章編號 1007-7731（2023）05-0031-06

Study on Liquid Fermentation Culture and Extraction Technology of Melanin from

Auricularia auriculata

WANG Xiaoman? ?CHAI Xinyi? ?YU Shijuan? ?XIANG Yuyong? ?SUN Xing

（School of Biology and Food Engineering， Chuzhou University， Chuzhou Anhui 239000）

Abstract In order to improve the yield of Auricularia auricula melanin， the melanin in liquid fermentation mycelium of Auricularia auricula was extracted by alkali solution and acid precipitation. Taking the yield of melanin as the index， the liquid fermentation production and extraction conditions of Auricularia auricula melanin were studied by single factor test and orthogonal design test. The results showed that the optimum liquid fermentation conditions of Auricularia auricula melanin were as follows：initial pH 5.5， 25 ℃ and culture for 9 days; The optimum extraction conditions were NaOH concentration of 2 mol/L，solid-liquid ratio of 1∶40 and extraction for 1.5 h. The yield of melanin from Auricularia auricula can reach 1.55%. The results can provide an important reference for the industrial liquid fermentation of Auricularia auricula to produce melanin.

Keywords Auricularia auricula melanin; liquid fermentation; melanin yield; optimization of process conditions

黑木耳（Auricularia auricula）隸屬擔子菌亞門（Basidiomycotina）、層菌綱（Hymenomycetes）、木耳目（Auriculariales）、木耳科（Auriculariaceae）、木耳屬（Auricularia），在我國云南、東北、河南等多地廣泛分布[1]。黑木耳中富含蛋白質、多糖、氨基酸、黑色素、黃酮、多酚等多種生物活性化合物，兼有優良的食用與藥用價值[2]。其中，黑色素是黑木耳最主要的活性物質之一，黑木耳子實體呈現黑褐色就是其富含黑色素的緣故[3]。黑色素是一種氨基酸衍生物，是由多羥基酚類或吲哚類物質氧化聚合而成的大分子疏水性生物聚合體[4]。黑木耳黑色素的安全性高，且具有抗輻射、抗氧化、清除自由基與提高免疫力等多方面的生理功能，是極具發展潛力的天然功能性色素[5-9]。黑木耳的傳統栽培是采用固體菌種進行接代轉接，每一代都需要經過60～90 d的栽培，周期較長，同時由于環境等不可控因素會導致栽培過程中容易出現菌齡不一致、污染率高以及生產效率低下等問題。微生物深層液體發酵生產技術的逐步成熟，因其具有周期短、成本低、便于分離純化等優勢而引起廣泛關注[10-11]。已有研究表明，深層液體發酵的黑木耳在營養價值以及生理活性方面并不比傳統栽培技術獲得的黑木耳低，其中液體發酵的成分含量甚至高于黑木耳子實體中的含量[12-15]。鑒于此，為提高黑木耳黑色素的產量，本研究以堿溶酸沉法對黑木耳液體發酵菌絲體中的黑色素進行提取，以黑色素得率為指標，采用單因素試驗和正交設計試驗，對黑木耳黑色素的液體發酵生產及提取工藝條件進行了研究，以期為黑木耳黑色素的工業化生產提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌種。本試驗使用黑木耳109菌種，購自山東耀勝生物科技有限公司。

1.1.2 試驗試劑。PDA培養基（南通凱恒生物科技有限公司）；葡萄糖（天津市匯杭化工有限公司）、酵母膏（杭州百思生物技術有限公司）、MgSO4·7H2O（上海強順化工有限公司）、KH2PO4（天津市致遠化學試劑有限公司）、HCl、NaOH（上海振企化學試劑有限公司）等均為分析純。

1.1.3 儀器設備。高壓蒸汽滅菌鍋（BXM-30R型立式壓力蒸汽滅菌鍋）；超凈工作臺（SW-CJ-1BU，蘇州新區楓橋凈化設備廠）；高速離心機（H2-16K，湖南可成儀器設備有限公司）；搖床（ZD-85A，常州國宇儀器制造有限公司）；培養箱（DNP-9402AE型，上海三發科學儀器有限公司）；干燥箱（DHG-9203A，上海三發科學儀器有限公司）等。

1.2 方法

1.2.1 菌種活化。配置PDA培養基（馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL，pH自然），將培養基與培養皿放入高壓蒸汽鍋滅菌。滅菌后，在超凈工作臺制作PDA平板，并使用接種環挑取黑木耳斜面菌種，接種于PDA平板，然后將平板置于28 ℃培養箱中培養10～14 d，冰箱4 ℃保存備用。

1.2.2 液體發酵培養。液體發酵培養基配方[16]：20%葡萄糖，2%酵母膏，0.2% KH2PO4，0.1% MgSO4·7H2O。將上述液體發酵培養基按照40%的裝液量分別裝于250 mL的錐形瓶中，隨后進行高壓蒸汽滅菌。滅菌冷卻后，于超凈工作臺無菌條件下用接種環挑取3～4個約1 cm2大小的菌種塊，接種于液體發酵培養基中。接種后，為讓菌種充分活化，便于菌種萌發，將三角瓶先置于25 ℃恒溫培養箱中靜置培養1 d。第2 d再置于25 ℃的搖床中以150 r/min振蕩培養7 d。

1.2.3 黑木耳液體發酵菌絲體中黑色素的提取。用8層紗布過濾黑木耳液體發酵培養液中的菌絲體，并用蒸餾水反復沖洗過濾2～3次，過濾后的菌絲體置于65 ℃的干燥箱中干燥24 h，取干燥后的菌絲體置于研缽中研磨成顆粒狀或者粉狀，保存備用。采用堿溶酸沉法進行黑色素的提取[17-18]，其具體操作步驟：①精確稱取0.2 g黑木耳菌絲體粉末狀樣品，加入試管中，按照1∶30的料液比，加入1 mol/L NaOH溶液，攪拌均勻后，置于80 ℃水浴鍋中浸提1 h；②使用高速離心機在10 000 r/min的條件下對步驟①的浸提液離心15 min，離心后取上清液置于試管中；③使用1.5 mol/L HCl溶液調節pH至1.5，隨后放入水浴鍋中浸提12 h；④12 h后，將浸提液7 500 r/min高速離心10 min，保留沉淀棄上清液，此時的沉淀即為黑色素粗品；⑤重復①～④步驟2～3次，使用去離子水對最終沉淀物反復清洗3～4次，收集沉淀物，即為黑色素純品，干燥后置于-20 ℃保存。

1.2.4 黑色素得率的測定。黑色素的質量采用恒重差值法測定。將培養皿和濾紙提前置于105 ℃干燥箱中，烘干至恒重（±0.000 1 g），稱重。將上述提取的黑色素產品倒入已恒重的裝有濾紙的培養皿中再次烘干至恒重，稱量。前后差值即為黑色素純品的質量。黑色素得率計算公式：黑色素得率（%）=（黑木耳黑色素純品質量÷黑木耳菌絲體質量）×100。

1.2.5 黑木耳黑色素液體發酵培養條件的研究。（1）最適起始pH篩選。因為黑木耳生長環境為酸性[19]，所以分別設置起始pH值為4.5、5.0、5.5、6.0、6.5的液體發酵培養基，按照40%的裝液量將搖瓶液體發酵培養基分裝在250 mL三角瓶中，每個處理3個重復，在121 ℃下高壓蒸汽滅菌20 min。待滅菌冷卻后，無菌條件下分別接入3～4個約1 cm2大小的菌種塊。接種后，置于28 ℃恒溫培養箱中靜止培養1 d，再放入25 ℃的搖床中以150 r/min培養7 d。按照1.2.4中的方法進行黑木耳黑色素得率的測定。

（2）最適溫度篩選。使用上述篩選得到的最適pH，按照40%的裝液量將液體發酵培養基分裝在250 mL的三角瓶中，共計15瓶。在121 ℃下高壓蒸汽滅菌20 min。待滅菌冷卻后，無菌條件下分別接入3～4個約1 cm2大小的菌種塊。接種后，置于28 ℃恒溫培養箱中靜止培養1 d，然后，分別置于17、21、25、29、33℃的培養溫度下，以150 r/min培養7 d，每個不同處理3個重復。隨后，按照1.2.3和1.2.4中的方法進行黑木耳黑色素得率的測定。

（3）最適培養天數篩選。利用上述篩選得到的最佳培養起始pH配制液體發酵培養基，按照40%的裝液量將液體發酵培養基分裝在250 mL三角瓶中，共計15瓶。在121 ℃下高壓蒸汽滅菌20 min。待滅菌冷卻后，無菌條件下分別接入3～4個約1 cm2大小的菌種塊。接種后，置于28℃恒溫培養箱中靜止培養1 d，然后以轉速150 r/min的搖床分別培養5、7、9、11、13 d，每個處理3個重復。隨后，按照1.2.4中的方法進行黑木耳黑色素得率的測定。

1.2.6 黑木耳液體發酵菌絲體中黑色素的提取工藝研究。（1）最適浸提時間篩選。按照1.2.3中方法，獲得黑木耳液體發酵菌絲體粉末狀樣品。在采用堿溶酸沉法進行黑色素的提取時，分別設置浸提時間為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h的不同試驗處理，每個處理3個重復，根據1.2.4中的方法，獲得不同處理的黑色素得率，通過不同處理之間的差異性分析，獲得黑木耳液體發酵菌絲體中黑色素的最佳浸提時間。

（2）浸提最適NaOH濃度篩選。在采用堿溶酸沉法進行黑色素的提取時，設置NaOH濃度為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mol/L的5個不同處理，每個處理3個重復。根據上述試驗篩選的最佳浸提時間進行黑木耳液體發酵菌絲體粉末狀樣品中黑色素的提取，根據1.2.4中的方法，獲得不同處理的黑色素得率，通過不同處理之間的差異性分析，獲得黑木耳液體發酵菌絲體中黑色素提取時的最佳NaOH濃度。

（3）浸提最適料液比篩選。采用堿溶酸沉法進行黑色素的提取時，料液比分別按照1∶20、1∶25、1∶30、

1∶35、1∶40 5個不同的試驗處理進行設置，每個處理3個重復。依據上述試驗篩選的最佳浸提時間和NaOH濃度進行黑木耳液體發酵菌絲體粉末狀樣品中黑色素的提取，根據1.2.4中方法，獲得不同處理的黑色素得率，通過不同處理之間的差異性分析，獲得黑木耳液體發酵菌絲體中黑色素提取時的最佳料液比。

1.2.7 黑木耳黑色素生產工藝條件的優化研究。為提高黑木耳黑色素的產量，對不同的液體發酵條件對黑木耳黑色素得率的影響進行了研究。在單因素試驗結果的基礎上進行了正交試驗優化研究，選取最優的溫度、pH以及培養天數3個因素，每個因素選取3個水平，設計L9（33）的正交試驗組，每個組合3個重復。

1.2.8 數據處理。利用Microsoft Excel 2020對各組單因素試驗結果進行統計整理以及繪圖。利用IBM SPSS Statistics 26的ANOVA功能對試驗結果進行方差分析以及顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 黑木耳黑色素液體發酵培養條件的研究

2.1.1 黑木耳黑色素發酵生產最適起始pH的篩選。由圖1可知，黑木耳在pH 5.5的條件下黑色素的得率最高，在pH低于5時黑色素的合成會受到抑制。這和黑木耳的生長環境有關，黑木耳菌絲的生長環境呈微酸性，黑木耳在生長過程分解蛋白質、淀粉以及纖維素等碳源和能源供于自身生長時，所需要的纖維素酶以及其他生長合成所需要的酶在偏酸的條件下活性高，但是酸性過強條件下可能會發生酪氨酸酶結構的異變從而影響黑色素得率。這與侯若琳等人的研究結果較為一致，侯若琳等[20]在采用纖維素酶聯合超聲提取的方法對黑木耳黑色素進行提取時發現，在pH為5時，黑木耳菌絲獲得率較高，因而黑木耳黑色素得率最高。

2.1.2 黑木耳黑色素發酵生產最適培養溫度的篩選。由圖2可見，溫度是考察黑色素培養工藝路線的一個重要指標，在25～33 ℃這個范圍內黑色素得率較高，29 ℃時，黑木耳黑色素得率最高，這與黑木耳的生長習性有關，黑木耳是中溫性真菌，溫度過高或過低都會抑制菌絲體的生長以及其體內酪氨酸酶的活性[21]。但本試驗液體發酵過程中，雖然29 ℃下所提取的黑色素含量最高，但其黑色素得率與在25 ℃處理之間差異不顯著。所以，從節約能源和降低成本方面考慮，生產中應選擇25 ℃作為黑木耳液體發酵生產黑色素的最佳溫度。

2.1.3 黑木耳黑色素發酵生產最適培養時間的篩選。圖3結果表明，培養天數對結果影響比較顯著，在第9 d時提取的黑色素得率最高，低于7 d以及高于11 d時黑色素含量明顯下降。這與菌絲的生長規律有關，培養時間過短黑色素未充分合成，時間過長黑色素被分解因此得率較低。張穎等[22]在通過研究刺五加水提液對黑木耳發酵及其胞內多糖的影響時也發現了這個規律，隨著黑木耳菌絲體液體發酵時間的延長，菌量不斷增加，但在第9 d后，菌絲體干重開始趨于穩定，說明發酵9 d能滿足黑木耳菌株菌絲體的充分生長，繼續延長發酵時間對菌絲體生長意義不大，因此選擇9 d為最適發酵時長。

2.2 黑木耳發酵菌絲體中黑色素的提取工藝研究

2.2.1 黑木耳發酵菌絲體最佳浸提時間的篩選。結果表明（見圖4），隨著浸提時間的延長，黑色素得率不斷增加，1.5 h時達到最高，但當浸提時間繼續延長時，黑色素得率卻開始下降。究其原因可能是因為黑色素的提取分離需要一定的時間，時間過短提取不充分，時間過長黑色素可能發生解離，且隨著浸提時間的延長，提取液的濃度和料液比發生變化，對黑色素的提取效果也會造成影響[5]，因此最佳浸提時間為1.5 h。

2.2.2 黑木耳發酵菌絲體中黑色素提取的最佳浸提NaOH濃度的篩選。鑒于堿溶液對黑色素選擇性高，溶解力強，提取率高，所以本試驗采用堿溶的方法對黑色素進行溶解分離，結果表明（圖5），NaOH濃度在2 mol/L時，提取效果最好。超過這個濃度，黑色素得率呈現明顯下降的趨勢，這是由于堿性過強會造成黑色素等活性物質的結構破壞，而堿性過低時無法充分溶解菌絲體中的黑色素，因此都會導致黑色素的得率降低。綜上所述，選擇2 mol/L作為黑木耳液體發酵菌絲體中黑色素提取的最佳NaOH濃度。

2.2.3 黑木耳發酵菌絲體中黑色素提取的最佳料液比篩選。由圖6可知，在1∶20～1∶40的料液比范圍內，隨著料液比的增加，黑色素的得率不斷上升，這是由于隨著料液比的比例不斷增加，體系中NaOH的占比逐漸升高，對黑色素的析出效果逐漸增強。因此，本試驗選用1∶40為最佳提取料液比。

2.3 黑木耳黑色素液體發酵培養條件的優化研究

在上述單因素試驗結果的基礎上，選取最佳溫度、起始pH、培養時間等3個因素，每個因素選取3個水平，設計L9（33）的正交試驗組，每個組合3個重復。正交試驗設計見表1。

黑木耳黑色素液體發酵的培養條件優化試驗結果見表2。結果表明，對黑木耳液體發酵菌絲體中的黑色素得率影響的主次排序為A（pH）>B（培養天數）>C（溫度），說明pH對黑色素得率的影響最大，為主要影響因素，溫度對黑色素得率的影響最小。3種因素最佳組合為A2B2C1，即pH為5.5，培養天數為9 d、溫度為25 ℃，此時的黑木耳黑色素得率可達1.55%。

3 結論與討論

黑色素作為黑木耳的主要活性成分之一，在其生物功效上發揮著重要作用，如何高效生產和提取黑木耳黑色素對生產應用十分重要。本研究通過單因素試驗和正交優化設計試驗結果表明，黑木耳黑色素的最優液體發酵生產培養條件為起始pH 5.5、25℃、培養9 d。針對黑色素在堿性溶液中溶解度高，而酸性溶液中溶解度往往較小的原理，我們采用堿溶酸沉法提取黑色素。堿溶酸沉法是黑色素提取中最常用的方法，具有操作簡便、效果穩定等優點。研究發現，從黑木耳液體發酵菌絲體中提取黑色素的最佳提取工藝條件為NaOH濃度2 mol/ L、料液比1∶40、浸提1.5 h，黑木耳黑色素得率可達1.55%。

王謙等[23]采用單因子分析和正交實驗，對黑木耳深層液體發酵的條件進行了優化研究，并得到了適合液體發酵的最佳條件為pH 5.0，培養溫度28 ℃。范心樂等[5]通過對毛木耳的提取工藝優化研究，表明在NaOH濃度為1.5 mol/L時黑色素提取率最高。李琦等[24-26]通過研究黑木耳黑色素的得率影響因素時發現在浸提時間為1.5 h時黑色素得率較高；吳晨霞等[27]通過對木耳黑色素的提取優化發現料液比為1∶40時，黑色素提取率最高，與本研究結果比較一致。目前對于黑木耳黑色素的研究主要集中在生物醫藥、食品工業以及微生物發酵方面，而對于其提取條件的優化以及成分結構等方面的研究較少[28]。因此，今后應加強黑木耳黑色素的提取優化及結構分析等方面的研究，同時，應加強黑色素應用方面的研究。

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（責編：張 蓓）

基金項目 安徽省科技廳科技成果轉移轉化鄉村振興科技項目（202107d06020018）；安徽省高等學校本科質量工程項目（2020jyxm1322、2020xsxxkc314）；滁州學院開放實驗項目（kfsy2130）。

收稿日期 2022-05-08