魚膠原蛋白肽經Strat-MTM 膜透皮吸收試驗研究

劉利格，李志國，宋 萃，許智敏，劉愛青，高建萍，王海燕

（1. 北京盛美諾生物技術有限公司，北京 100062；2.中國科學院過程工程研究所生化工程國家重點實驗室，北京 100190；3. 中國科學院大學 化學工程學院，北京 100049）

0 引言

魚膠原蛋白肽是以魚皮、魚鱗、魚骨等為原料經蛋白酶水解后的產物，具有多種生理調節功能，如美容護膚、補鈣健骨[1]、止血免疫[2]、保肝護肝[3]、保護和修復胃黏膜[4-5]等。膠原蛋白肽除了具有報道的生物活性，還因其天然、安全、易配伍等特點，在食品、醫藥和化妝品領域廣泛發揮作用。關于膠原蛋白肽凝膠、膠原蛋白肽繃帶止血，促進傷口愈合[6-7]，膠原蛋白肽噴霧、膠原蛋白肽面膜（面霜）、眼霜改善皮膚狀態[8-9]等膠原蛋白肽外用制劑有效性的報道很多，但是外用膠原蛋白肽皮膚滲透性及作用機理等研究報道較少。

在醫藥和化妝品領域，體外透皮試驗經常用來進行外用制劑活性物質的篩選和滲透研究[10]。長期以來，離體動物皮膚被廣泛用于皮膚外用制劑的體外透皮研究，關于膠原蛋白肽的離體動物皮膚透皮吸收也有一些研究。影響膠原肽透皮的因素很多，透皮介質、膠原蛋白肽分子量大小、來源不同帶來的組成差異、促透劑的使用等。不同動物皮膚存在種屬、個體、部位、年齡、性別等差異，使得試驗的重復性和重現性不佳[11]。為解決上述問題，參考醫藥和化妝品人工膜透皮的研究，選擇Strat-MTM作為替代膜研究了其對魚膠原蛋白肽的透皮能力，為后續更深入的研究提供參考和依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

羅非魚魚皮膠原蛋白肽（M.W.500，M.W.1000）、羅非魚魚鱗膠原蛋白肽（M.W.500，M.W.1000） （以下簡稱YP500，YP1000，YL500，YL1000），北京盛美諾生物技術有限公司提供；Strat-MTM皮膚專用膜，美國默克密理博公司提供；羥脯胺酸（Hyp） 標準品、2,4 -二硝基苯肼，Sigma-Aldrich 公司提供；乙腈為色譜純；其他試劑均為分析純。

TP-6 型透皮擴散儀，天津天河分析儀器有限公司產品；Agilent 1100 型高效液相色譜儀，自動進樣器，DAD 檢測器，美國Agilent 公司產品。

1.2 試驗方法

1.2.1 羥脯胺酸含量測定

（1） 透皮接收液預處理。取接收液0.5 mL，加入等體積的濃鹽酸，真空封管，于110 ℃條件下水解20 h。水解液用濃度為6 mol/L 的氫氧化鈉溶液中和后，定容至2 mL。分別取空白、樣品、 Hyp 系列標準液100 μL，加入濃度為0.5mol/L 碳酸氫鈉溶液200 μL，1%2,4-二硝基氟苯乙腈溶液100 μL，60 ℃下衍生1 h。冷卻后加入0.1mol/L 磷酸二氫鉀溶液600 μL。離心后上機進樣。

（2） Hyp 標準溶液。Hyp 系列標準溶液質量濃度為5，10，20，50，100，200，400 μg/mL。

（3） 色譜條件。Agilent Zobax sb C18型色譜柱（5 μm，4.6×250 mm）；流動相：A 相為0.05 mol/L乙酸鈉，B 相為乙腈-水（1∶1），流速0.5 mL/min。梯度洗脫，程序為0~15 min：A 相由70%降至45%；15~25 min：A 相由45%升至100%；25~35 min：A相由100%降至70%；35~45 min：A 相70%；柱溫30 ℃，進樣量10 μL，檢測波長360 nm。

1.2.2 透皮試驗方法

人工膜直接固定在樣品池和接受池之間。

樣品池中為10%的膠原蛋白肽生理鹽水溶液，以生理鹽水作為空白對照。接受池中加滿生理鹽水，容量為17 mL，保持恒速攪拌和恒溫，水浴溫度37±0.5 ℃，轉速300 r/min。于2，4，6，8，24 h 分別取樣1 mL，同時補加等量的生理鹽水。測定取出液中Hyp 的質量濃度，按以下公式計算單位面積的累計透過量（Qn） 和透皮速率常數（J）：

式中：Cn——第n個取樣點測得的Hyp 質量濃度，μg/mL；

Ci——第i個取樣點測得的Hyp 質量濃度，μg/mL；

10——Hyp 與膠原蛋白肽的折算系數；

V——接受池容量，為17 mL；

V0——每個時間點分取體積，為1 mL；

A——滲透面積，為1.54 cm2。

以累積透過量Qn對時間t進行線性回歸，所得方程的斜率即為透皮速率常數J，單位為μg/cm2/h。

2 結果與分析

2.1 時間對魚膠原蛋白肽經Strat-MTM 滲透的影響

魚膠原蛋白肽經Strat-MTM透皮的單位面積累計透過量隨時間的變化趨勢見圖1。

圖1 魚膠原蛋白肽經Strat-MTM 透皮的單位面積累計透過量隨時間的變化趨勢

由圖1 可知，4 種魚膠原蛋白肽單位面積的累計透過量均隨著透皮時間延長不斷增加，且透皮速度（J） 存在差別，與文獻中大鼠、小鼠皮膚對膠原蛋白的透皮吸收趨勢一致[12-15]。

2.2 平均分子量對魚膠原蛋白肽經Strat-MTM 膜滲透的影響

YL500，YP500，YL1000 和YP1000 這4 種膠原蛋白肽的質量分數為10%，進行在24 h 內的Strat-MTM膜單位面積累計透過量（Q24）。

不同平均分子量魚膠原蛋白肽的24 h 內單位面積累計透過量見圖2。

圖2 不同平均分子量魚膠原蛋白肽的24 h 內單位面積累計透過量

由圖2 可知，低平均分子量膠原蛋白肽的Q24大于高平均分子量魚膠原蛋白肽，這與文獻中報道的膠原蛋白肽經離體小鼠皮膚的透皮趨勢一致，由于小鼠皮膚角質層的屏障作用，分子量越小的物質越易透過皮膚角質層，而分子量大的則較難被吸收[12-15]。同樣，Strat-MTM能夠區分不同分子量大小的膠原蛋白肽的透皮速率，可能與它具有多孔徑和擴散性不同的多層結構有關[16]。

另外，相同平均分子量的魚鱗、魚皮膠原蛋白肽的Q24也存在差異。劉楚怡等人[17]也報道了海蜇、牛骨和鱈魚皮膠原蛋白肽透皮速率隨時間變化存在差異。這一趨勢一方面可能與膠原蛋白肽的分子量大小分布有關，另一方面也可能與魚膠原蛋白多肽的辛醇-水分配系數有關：辛醇-水分配系數不同，各膠原蛋白肽與皮膚雙脂質層極性頭部的結合程度和穿膜速率不同；Strat-MTM浸漬了模擬皮膚脂質組成的C6-C26的合成脂質，對親水性和疏水性物質均有良好的透皮性質，通常親水性物質透膜速率大于親脂性物質[16]。

2.3 質量分數對膠原蛋白肽經Strat-MTM 膜滲透的影響

根據文獻報道，膠原蛋白肽溶液質量分數對經離體動物皮膚的透皮累計透過量有影響。為研究不同質量分數膠原蛋白肽對經Strat-MTM人工膜單位面積累計透過量的影響，分別配制質量分數（C） 為1%，5%和10%的YP500 和YL1000 的膠原蛋白肽溶液進行透皮試驗。隨著質量分數的增加，單位面積累計透過量增加，但最終透過量逐漸減小，與膠原蛋白肽質量分數對小鼠皮膚的透皮吸收影響類似[17]。這可能是由于質量分數不同帶來的供給液黏性變化造成的，溶液黏性增加使得透皮過程變得緩慢，其影響大于供給池和接受池質量分數差的影響。

不同質量分數膠原蛋白肽的24 h 內單位面積累計透過量見表1。

表1 不同質量分數膠原蛋白肽的24 h 內單位面積累計透過量

2.4 Strat-MTM 對膠原蛋白肽的透皮動力學分析

不同膠原蛋白肽經Strat-MTM的滲透動力學參數見表2。

表2 不同膠原蛋白肽經Strat-MTM 的滲透動力學參數

由表2 可知，各膠原蛋白肽經Strat-MTM膜透皮的單位面積累計透過量隨時間的延長呈線性增加，復合零級動力學方程。透皮吸收系數（J）即透皮速率常數，J（YP500）＞J（YL500）＞J（YP1000）＞J（YL1000）。

皮膚由多層結構組成，含有脂質組分最外層的角質層是阻止膠原蛋白肽透過的最大屏障。Clément P 等人[18]在研究中評價了含疏水材料和浸漬有模擬皮膚脂質物質的人工膜模擬動物皮膚透皮性能的重要性。Uchida T 等人[19]通過掃描電鏡和透射電鏡對Strat-MTM的結構進行觀察，確認其具有3 層結構，密度由上至下依次減小，脂質存在于上面2 層，使得Strat-MTM具有滲透梯度，可以更好地模擬動物皮膚。

3 結論

在透皮試驗中，人工合成膜用來模擬人體皮膚。作為離體人體和動物皮膚替代品，人工膜操作簡單，結果重現性好，較生物膜易于獲取和儲存、試驗重復性好[20]，不涉及倫理問題。常用的透皮滲透人工膜有聚硅氧烷基膜，如SilatosTM、Silastic和聚二甲基硅氧烷[21]、纖維素膜[22-23]等，但藥物經Strat-MTM膜與經離體動物皮膚的滲透相關性比這些膜更好。與人體皮膚相似，Strat-MTM膜具有多個不同擴散性的分層。它的外側是兩層聚醚砜更耐擴散，底部是更開放和擴散的聚烯烴層。這些密度不同的聚合物形成多孔結構，不同的孔徑和擴散性使Strat-MTM具有滲透梯度，且在多孔結構浸漬了合成脂質混合物，更類似人體皮膚結構[19]。

試驗中，平均分子量500，1 000 Da 的羅非魚鱗、魚皮膠原蛋白肽經Strat-MTM膜滲透隨透皮時間的延長，單位面積累計透過量增加，復合零級動力學方程。不同平均分子量的膠原蛋白肽經Strat-MTM透皮速率存在差異。Strat-MTM可作為離體動物皮膚的替代膜進行透皮試驗研究。