超聲波輔助酶法提取橙皮果膠的工藝研究

王祥雨，徐新奧，陳 鑫，詹婧嫻，祝方清

（湖北大學知行學院糧食與食品工程學院，湖北武漢 430011）

果膠作為一種天然的植物細胞壁多糖，占橙皮干質量的10%~30%。其作為一種聚合物，通常以原果膠、果膠和果膠酸的形式存在于橙皮類水果中[1]。根據(jù)天然果膠酯化度的高低程度，其還可大致分為高酯果膠、低酯果膠和半低酯酰胺化度果膠[2]。果膠具有促進體內胃腸黏膜蠕動、促進胃腸營養(yǎng)分解吸收等功能作用，對高血壓、腸癌、糖尿病癥和老年肥胖癥均有較好的調理效果[3]。在化妝品行業(yè)中，果膠還可保護皮膚免受陽光紫外線輻射、愈合創(chuàng)口和美容美顏等功能。

橙皮是橙子罐頭制作中的主要副產物，占橙子的總質量25%~40%。2022 年我國橙子總產量大約為750 萬t，約占全球總產量的1/7。在橙皮當中，含有豐富純天然的有益成分，如橙皮苷、果膠、檸檬酸等[4]。近年來，人們對天然產物資源的可持續(xù)發(fā)展觀正在不斷增強，橙皮的開發(fā)利用受到了廣泛的重視。大部分橙皮可被用于動物的飼養(yǎng)或者將其進行填埋處理，但作為動物飼料可能會發(fā)生霉變、腐爛或產生異味，填埋也將帶來嚴重的環(huán)境污染問題。因此，副產物橙皮的加工利用需要進一步探討和研究。值得注意的是，橙皮中的果膠具有膠凝、抗癌和抗腹瀉等功效。若可提取果膠成分，將帶動整個相關產業(yè)的發(fā)展，實現(xiàn)經濟效益和社會效益的提升。

果膠的提取過程是一個非水溶性果膠轉化為水溶性果膠、水溶性果膠進而向液相轉移的過程[5]。傳統(tǒng)的果膠提取方法有酸萃取法、堿萃取法、鹽析法、微生物法、微波的輔助提取法、酶法和離子交換樹脂法等[6-8]，其中，酸萃取法是提取果膠方法中效率最高的方法之一。同時，超聲波輔助法提取果膠的提取率可達20%及以上，容易控制提取條件且污染小，但國內該方法研究仍有發(fā)展空間，目前有關超聲波輔助酶法提取果膠的工藝研究也正在逐漸受到業(yè)內人士的關注和重視[9-10]。因此，利用超聲波法輔助酶法提取酸性果膠。

以橙子作為研究對象，采用超聲波輔助酶法提取天然果膠，采用單因素試驗及正交試驗探究其最優(yōu)的果膠提取工藝。單因素試驗的四因素分別為料液比、溶劑pH 值、超聲波浸提溫度和超聲波浸提時間，在該條件下得出最優(yōu)果膠提取率，并繪制曲線圖。正交試驗即建立于單因素試驗之上，獲得最佳工藝參數(shù)下的果膠提取率。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

材料：橙子；95%乙醇、檸檬酸鈉（分析純），國藥集團化學試劑有限公司提供；纖維素酶，南寧龐博生物工程有限公司提供。。

儀器：FA1104 型分析天平，上海精科天平有限公司產品；SHA-B 型雙功能水浴恒溫鍋，常州國華電器有限公司產品；TG16G 型臺式高速離心機，常州市金壇高科儀器廠產品；UP500H 型超聲波清洗儀，南京壘君達超聲電子設備有限公司產品；D2X-6020B 型真空干燥箱，上海福瑪實驗設備有限公司產品。

1.2 試驗方法

1.2.1 果膠提取工藝流程

橙子清洗去皮→橙皮預處理（沸水去酶→切粒后熱水漂洗除去糖分和色素→瀝水后置于60 ℃烘箱干燥至恒重→粉碎后過90 目篩，備用） →高溫滅酶處理→橙皮粉與溶劑料液比配置、稀鹽酸調節(jié)pH 值以及控制超聲波的溫度和時間→超聲波輔助酶法提取→高溫滅酶處理→高速旋轉離心過濾處理→沉淀分離→分離提純處理→60 ℃烘箱干燥至恒重→獲得果膠成品，即可稱量計算。

1.2.2 橙皮原材料的預處理

選取新鮮橙子后，對其進行清水漂洗取橙皮，將干凈橙皮置于水浴鍋中，升溫至90 ℃保持10 min，利用沸水漂洗；隨后，將橙皮切成2~3 mm 小顆粒，用熱水漂洗數(shù)次直至水流無色，除去水溶性色素和糖分等；橙皮顆粒洗凈后瀝干水分，將其均勻分散地放入60 ℃烘箱中。烘干后，將其用粉碎機粉碎，90 目過篩，將橙皮粉置于干燥器中，備用。

1.2.3 超聲波輔助酶法處理

稱取10.0 g 干燥的橙皮粉，先加入一定的料液比，再加入適量的纖維素酶。攪拌均勻后，利用檸檬酸緩沖液調節(jié)其pH 值，并在特定溫度下進行超聲波處理。隨后，將溶液置于85~90 ℃水浴鍋中進行水浴滅酶10 min。在25 ℃條件下，以轉速4 000 r/min離心10 min。取上清液，在攪拌的狀態(tài)下加入95%的無水乙醇，靜置30 min，待其析出絮狀沉淀，再以轉速4 000 r/min 離心10 min。取下層膠狀沉淀物質，并置于60 ℃烘箱中進行干燥至恒質量，計算其果膠提取率。

1.2.4 單因素試驗設計

單因素試驗為五因素五水平試驗，對各個因素的不同水平下果膠提取率的變化進行記錄，在固定的超聲波儀器功率下，選取5 個因素（橙皮粉與溶劑的料液比、加酶量、溶液的pH 值、超聲波的浸提溫度和超聲波的浸提時間） 探究料液比（1∶10，1∶15，1∶20，1∶25，1∶30）、加酶量（0.03，0.05，0.07，0.09，0.11 g）、溶劑pH 值（4.1，4.3，4.5，4.7，4.9）、超聲波提取溫度（35，40，45，50，55 ℃）、超聲波提取時間（30，35，40，45，50 min） 對果膠提取率的影響，并繪制曲線圖。根據(jù)料液比、pH 值、提取溫度和提取時間對果膠提取率的影響，得出每個因素的最優(yōu)條件。

（1） 料液比對果膠提取率的影響。稱取10 g 橙皮粉，將橙皮粉與蒸餾水的料液比進行梯度稀釋，加入0.07 g 纖維素酶，并用稀鹽酸將pH 值調至4.5，超聲波提取溫度為45 ℃，超聲波提取時間為40 min。超聲完成后，將其進行高速離心，取上清液加入乙醇。靜置30 min 后，將析出的沉淀再次高速離心，取膠狀物進行烘干，稱量并計算。分析料液比為1∶10，1∶15，1∶20，1∶25，1∶30 對果膠提取率的影響，并繪制曲線圖。

（2） 加酶量對果膠提取率的影響。稱取10 g 橙皮粉，選取最佳料液比1∶20。高溫滅酶冷卻后，加入一定量的纖維素酶，并用稀鹽酸將pH 值調至4.5，超聲波提取溫度為45 ℃，超聲波提取時間為40 min。超聲完成后，將其進行高速離心，取上清液加入乙醇。靜置30 min 后，將析出的沉淀再次高速離心，取膠狀物進行烘干，稱量并計算。分析纖維素酶含量為0.03，0.05，0.07，0.09 g 以及0.11 g 對果膠提取率的影響，并繪制曲線圖。

（3） pH 值對果膠提取率的影響。稱取10 g 橙皮粉，選取最佳料液比1∶20。高溫滅酶冷卻后，加入0.07 g 纖維素酶。將溶液pH 值調至一定條件，超聲波提取溫度為45 ℃，超聲波提取時間為40 min。超聲完成后，將其進行高速離心，取上清液加入乙醇。靜置30 min 后，將析出的沉淀再次高速離心，取膠狀物進行烘干，稱量并計算。分析溶液pH 值為4.1，4.3，4.5，4.7，4.9 對果膠提取率的影響，并繪制曲線。

（4） 提取溫度對果膠提取率的影響。稱取10 g橙皮粉，選取最佳料液比1∶20。高溫滅酶冷卻后，加入0.07 g 纖維素酶，并用稀鹽酸將pH 值調至4.5。將超聲波浸提溫度調至一定條件，超聲40 min。超聲完成后，將其進行高速離心，取上清液加入乙醇。靜置30 min 后，將析出的沉淀再次高速離心，取膠狀物進行烘干，稱量并計算。分析超聲波提取溫度為35，40，45，50，55 ℃對果膠提取率的影響，并繪制曲線圖。

（5） 提取時間對果膠提取率的影響。稱取10 g橙皮粉，選取最佳料液比1∶20。高溫滅酶冷卻后，加入0.07 g 纖維素酶。將溶液pH 值調至4.5，超聲波提取溫度為45 ℃，超聲波浸提時間調至一定時間。超聲完成后，將其進行高速離心，取上清液加入乙醇。靜置30 min 后，將析出的沉淀再次高速離心，取膠狀物進行烘干，稱量并計算。分析超聲波提取時間為30，35，40，45，50 min 對果膠提取率的影響，并繪制曲線圖。

1.2.5 正交試驗設計

在單因素試驗優(yōu)化的基礎上，利用四因素三水平正交表L9（34）對橙皮粉與溶劑的加酶量、pH 值、超聲波浸取溫度和超聲波浸取時間進行正交試驗。

稱取10 g 橙皮粉，按照表1 配制料液比（1∶15，1∶20，1∶25）、溶劑pH 值（1.5，2.0，2.5）、超聲波提取溫度（60，70，80 ℃） 和超聲波提取時間（40，50，60 min），探究在互相影響情況下4 個因素對果膠提取率的影響，確定最優(yōu)提取工藝。

表1 正交試驗的組合因素與水平設計

正交試驗的組合因素與水平設計見表1。

2 結果與分析

2.1 果膠提取單因素試驗結果與分析

2.1.1 料液比對果膠提取率的影響

料液比對果膠提取率的影響見表2，料液比對果膠提取率的影響見圖1。

圖1 料液比對果膠提取率的影響

表2 料液比對果膠提取率的影響

由圖1 可知，料液比為1∶10~1∶20（g∶mL）時，隨著料液比增加提取率逐漸增加；料液比為1∶20（g∶mL） 時，果膠提取率達到最大值；料液比為1∶20~1∶50（g∶mL） 時，隨著料液比增加提取率反而逐漸減少。這主要是料液比越小，果膠提取液的黏度越高，提取液分子擴散率將會越低，不利于超聲波傳導和果膠溶解。若料液比過低，則會導致果膠的提取液過于黏稠，使得果膠提取率過低，會大大增加果膠提取的工藝成本。當適當增加料液比時，可以提高纖維素酶對果膠的提取率。因此，選擇最優(yōu)料液比為1∶20（g∶mL）。

2.1.2 加酶量對果膠提取率的影響

加酶量對果膠提取率的影響見表3，加酶量對果膠提取率的影響見圖2。

圖2 加酶量對果膠提取率的影響

表3 加酶量對果膠提取率的影響

由圖2 可知，當加酶量＜0.07 g 時，隨著纖維素酶的增加，果膠提取率逐漸升高；當加酶量＞0.07 g 時，隨著纖維素酶的增加，果膠提取率逐漸下降。在通常情況下，酶的酶促反應速率與酶的添加量呈正比關系。隨著纖維素酶含量的增加，果膠的提取率加快，因為纖維素酶會破壞橙皮細胞的細胞壁，導致果膠從中溶解，從而提高提取率。但纖維素酶含量過高時，橙皮溶解物已經完全與纖維素酶結合在一起，果膠提取率不會大幅度發(fā)生變化。因此，選取最優(yōu)加酶量為0.07 g。

2.1.3 pH 值對果膠提取率的影響

pH 值對果膠提取率的影響見表4，pH 值對橙皮果膠提取率的影響見圖3。

圖3 pH 值對橙皮果膠提取率的影響

表4 pH 值對果膠提取率的影響

由圖3 可知，pH 值為4.1~4.9 時，橙皮中果膠提取率隨著pH 值的增大，呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢；當pH 值為4.5 時，果膠提取率達到最大值，這是由于pH 值低于4.5 時，溶液的酸性太強影響了纖維素酶的活性；pH 值高于4.5 時，提取液酸性減弱，使得橙皮中原果膠的水解程度隨著提取液pH 值的升高而降低，從而導致了纖維素酶提取果膠效率降低。因此提取液pH 值選為4.5。

2.1.4 提取時間對果膠提取率的影響

提取時間對果膠提取率的影響見表5，提取時間對果膠提取率的影響見圖4。

圖4 提取時間對果膠提取率的影響

表5 提取時間對果膠提取率的影響

由圖4 可知，當提取時間為30~45 min 時，隨著超聲時間的增加，果膠提取率也逐漸增大。當超聲波提取時間超過45 min 時，果膠提取率顯著下降。適當?shù)某暷芰靠梢愿淖兝w維素酶的構象，當纖維素酶的構象發(fā)生變化時，纖維素酶的活性中心就會暴露出來，這就增加了橙皮物質與纖維素酶的活性中心結合在一起的機會，從而加快了酶反應進程。但是，超聲物理能量作用達到一定程度后，其作用有減弱的趨勢，超聲波作用時間過長，會導致橙皮物質結構發(fā)生改變，與纖維素酶結合部位減少。因此提取時間選為40 min。

2.1.5 提取溫度對果膠提取率的影響

提取溫度對果膠提取率的影響見表6，提取溫度對果膠提取率的影響見圖5。

圖5 提取溫度對果膠提取率的影響

表6 提取溫度對果膠提取率的影響

由圖5 可知，提取溫度有先升高后降低的趨勢，當提取溫度為45 ℃時，不能使果膠稀釋出，降低了果膠提取率。在45 ℃以上時，溶液中的纖維素酶活性下降，影響了果膠的提取。因此，提取溫度選擇45 ℃。

2.2 正交試驗結果與分析

通過單因素試驗結果發(fā)現(xiàn)，加酶量、pH 值、提取溫度和提取時間對果膠提取效果有著較大影響，由此選用此四因素做正交試驗，進一步考查其影響因素。

果膠提取正交試驗數(shù)據(jù)直觀分析見表7。

表7 果膠提取正交試驗數(shù)據(jù)直觀分析

由表7 可知，4 個因素對果膠的提取率的影響分別是提取溫度（C） ＞加酶量（A） ＞提取時間（D） ＞pH 值（B）。根據(jù)擇優(yōu)選擇最高果膠提取率的原則，橙皮果膠的最佳提取水平是A1B1C2D1，加酶量為0.05，pH 值為4.3，提取溫度為50 ℃，提取時間為35 min。在此條件下，果膠提取率達到最高，為17.42%。

3 結論

在五因素五水平的單因素試驗及正交試驗中，提取溫度對果膠影響曲線圖坡度最大，其對提取率影響最大。因此，提取溫度是提取果膠成敗的關鍵因素。通過對果膠的提取率進行分析，得出了超聲波輔助纖維素酶提取的最佳工藝條件。適當?shù)某暡l件不僅有利于橙皮果膠的提取，還可以提高纖維素酶活力。在最優(yōu)條件為加酶量為0.05，pH 值為4.3，提取溫度50 ℃，提取時間為35 min 條件下，橙皮果膠的最佳提取率為17.42%。以超聲波輔助酶法提取橙皮果膠工藝的方法提取果膠不僅能縮短繁雜的工藝流程，還能顯著提升果膠的提取率，為日后超聲波輔助酶法提取果膠在食品工業(yè)領域的應用提供理論依據(jù)。