超高壓液相色譜-串聯四極桿質譜法檢測雞蛋中氯霉素的殘留量

◎ 張貴會，金 定，高友漢，王海彬，李文欣，張 波，王 楠

（扎魯特旗市場檢驗檢測中心，內蒙古 通遼 029100）

氯霉素屬于酰胺醇類廣譜抗生素，其對多數革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌均有良好的抑制作用，廣泛用于畜禽及水產動物傳染疾病的預防和治療[1-3]。但氯霉素殘留對人體的骨髓造血功能有抑制作用，可引起再生障礙性貧血。我國農業農村部公告第250 號《食品動物中禁止使用的藥品及其他化合物清單》中規定氯霉素（Chloramphenicol）及其鹽、酯是食品動物中禁止使用的藥品[4]。雞蛋含有豐富的蛋白質、脂肪和人體所需要的微量元素，已經成為人們生活中必備的食品之一。但由于一些養殖戶在養殖過程中違規使用氯霉素等獸藥，近年來雞蛋中也經常檢出氯霉素殘留[5-7]，嚴重威脅人們的生命健康安全。

目前氯霉素的檢測方法主要有液相色譜-質譜法[8]，氣相色譜-質譜法[9]、氣相色譜法[10]、液相色譜法[11]、膠體金免疫層析法[12]，這些檢測方法主要應用于牛奶、蜂蜜、可食動物肌肉、肝臟和水產品，但雞蛋中氯霉素的檢測方法沒有國家標準，本實驗在GB/T 22338—2008[13]和DB37/T 3118—2018 標準基礎上進行優化，樣品經乙酸乙酯和乙腈提取，乙腈復溶，正己烷除脂，經Thermo C18柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）分離，以水乙酸銨溶液和乙腈乙酸銨溶液為流動相進行梯度洗脫，電噴霧負離子模式，選擇反應離子監測，同位素內標法定量。本方法操作簡便，重現性好，準確度高，適合大批量雞蛋中氯霉素殘留量的檢測。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Thermo 超高壓液相色譜串聯四極桿質譜聯用儀（美國賽默飛世爾有限公司）；旋轉蒸發儀FR-5299（通遼玻璃生化儀器廠）；電子天平MS105DU（上海梅特勒儀器有限公司）；固相萃取裝置（南京萊伯特瑞儀器有限公司）；超純水機（成都優普有限公司）；RDE-1 高速勻漿機（江蘇儀器有限公司）；TGL20M醫用低溫離心機（凱達儀器有限公司）；ORN-II 氮吹儀（上海歐讓科技有限公司）。

氯霉素（甲醇溶劑100 μg·mL-1，批號A21060395，北京壇墨質檢）；氯霉素D5（甲醇溶劑100 μg·mL-1，批號A21070082，北京壇墨質檢）；LC-Si 硅膠小柱（500 mg/3 mL，美國waters 公司）；C18固相萃取小柱（500 mg/3 mL，美國waters 公司）；乙腈、甲醇（美國Thermo 有限公司）；碳酸鈉、碳酸氫鈉、乙酸乙酯、正己烷和乙酸銨，均為市售分析純。

1.2 方法

1.2.1 標準溶液的配制

內標溶液：稱取氯霉素D5標準儲備液，用甲醇稀釋成500 ng·mL-1的使用液。精密量取100 μg·mL-1氯霉素標準儲備液，用甲醇配制成氯霉素標準中間液。精密吸取1.0 μg·mL-1的氯霉素的標準中間液并加入一定量的內標氯霉素D5使用液，用空白樣品提取液稀釋定容100 mL，配制成濃度為0.110 ng·mL-1、0.510 ng·mL-1、1.000 ng·mL-1、5.000 ng·mL-1和10.000 ng·mL-1的標準工作溶液，系列溶液中含內標濃度為10 ng·mL-1，現用現配。

1.2.2 色譜條件

色譜柱：Thermo C18柱；柱溫：40 ℃；進樣量：20 μL；流速：0.2 mL·min-1。流動相：A 為水乙酸銨溶液，B 為乙腈乙酸銨溶液；梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序表

1.2.3 質譜條件

電噴霧離子源（ESI）；掃描方式：負離子掃描；噴霧電壓：2 500 V；檢測方式：選擇離子監測（SRM）；噴霧溫度：350 ℃；離子源傳輸管：270 ℃；碰撞氣壓力：1.5 mTorr；輔助氣流速：15 arb；其他質譜參數見表2。

表2 氯霉素和氯霉素-D5 特征離子參考質譜條件表

1.2.4 樣品前處理

稱取混勻雞蛋樣品5.0 g，于50 mL 塑料離心管中。準確加入100 ng·mL-1的內標工作液0.1 mL，加入20 mL 乙酸乙酯，2.00 mL 碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖溶液。均漿提取5 min，8 000 r·min-1離心5 min，將上層溶液轉移至雞心瓶中，于殘渣中加入20 mL 乙腈重復提取，合并2 次提取液于雞心瓶中真空減壓濃縮至干。殘渣用2 mL 乙腈復溶，同時加入10 mL 正己烷去脂，渦旋混勻。分取乙腈層，正己烷層復加入2 mL 乙腈萃取，分取乙腈層，合并兩次乙腈層于同一離心管中，于50 ℃氮吹至干。用1.00 mL 水復溶殘渣，過0.22 μm有機微孔濾膜，待測。

2 結果與分析

2.1 色譜條件的優化

本實驗采用Thermo C18色譜柱，比較了《蜂蜜中氯霉素殘留量的測定方法 液相色譜-串聯質譜法》（GB/T 18932.19—2003）、《動物源食品中氯霉素殘留量的測定 高效液相色譜-串聯質譜法》（農業部781 號公告-2-2006）和《動物源性食品中氯霉素類藥物殘留量測定》（GB/T 22338—2008）3 種方法的流動相。選擇水-乙腈和甲醇-水作流動相時，氯霉素出峰時間較早，易受溶劑峰和雜質峰干擾，從而影響定性定量結果。而乙酸銨水溶液和乙腈乙酸銨溶液作為流動相梯度洗脫，氯霉素和氯霉素-D5保留時間分別為4.00 min 和3.99 min，峰形對稱，峰形效果較好。氯霉素和氯霉素-D5的選擇反應離子監測圖見圖1。由圖1 可知氯霉素和氯霉素-D5定量離子和定性離子出峰時間穩定，靈敏度高，重現性好。

圖1 氯霉素和氯霉素-D5 標準溶液（10 ng·mL-1）的選擇反應離子監測圖

2.2 提取溶劑的優化

氯霉素為弱極性物質，在有機溶劑中有較強的保留。本文提取方法參考楊潔等[14]和許珊珊等[15]采用的純乙酸乙酯、純乙腈、乙酸乙酯和乙腈共同提取，對氯霉素提取效率進行考察。除提取溶劑外其他條件均相同，向雞蛋中分別添加1.0 ng·mL-1濃度的標準溶液，每種基質3 次平行，3 種基質的回收率見表3。由表3 可見，采用乙酸乙酯+乙腈進行提取的效果要優于乙酸乙酯和乙腈的單獨提取效果，使用乙酸乙酯+乙腈復合溶劑提取可有效提高回收率，降低溶劑的基質效應，故本研究選取乙酸乙酯和乙腈復合提取溶劑，內標法定量，可有效減少基質干擾，增加氯霉素的提取率，保證方法的靈敏度和準確度。

表3 不同提取溶劑的提取效果表

2.3 凈化方法的優化

本實驗比較了LC-Si 硅膠小柱、C18固相萃取小柱及不過柱直接乙腈復溶正己烷除脂實驗方法。雞蛋液基質復雜，蛋白質及脂類含量高，LC-Si 硅膠小柱對樣品除雜效果不好，經過LC-Si 硅膠小柱的樣液進入質譜會造成質譜離子源和離子傳輸管污染。雞蛋液蛋白質和脂肪含量高，C18硅膠小柱容易被樣液堵塞，耗時較長，使實驗難以繼續。固相萃取柱為較昂貴的實驗耗材，且需要活化洗脫，對實驗操作人員素質要求高。綜合考察，選擇不過柱乙腈復溶正己烷除脂，氯霉素的回收率高，樣品雜質較少，操作簡便，節省實驗時間提高工作效率，適合大批樣品檢驗。

2.4 校準曲線、檢出限和定量限

用1.2.1 的方法配制標準工作曲線，在最優液相質譜條件下進樣，以氯霉素濃度X為橫坐標，以氯霉素峰面積Y為縱坐標，進行線性回歸計算。氯霉素標準曲線在0.110 ～10.000 ng·mL-1濃度范圍內線性良好，方程為Y=62 102.1X，相關系數（R2）等于0.999 9，可用于準確定量檢測氯霉素的含量。結合本方法的前處理方法，以S/N=3 計算本方法檢出限，氯霉素檢出限為0.1 μg·kg-1，以S/N=10 計算本方法的定量限為0.3 μg·kg-1。

2.5 精密度與回收率

向已知空白雞蛋樣品中添加濃度水平為0.3 μg·kg-1、1.0 μg·kg-1、10.0 μg·kg-1的氯霉素，進行回收率測定，每個添加濃度測定6 次，內標法定量，結果見表4。其回收率范圍為86%～118%，相對標準偏差≤5.0%，表示該方法的精密度和準確度良好，滿足實驗要求。

表4 氯霉素加標回收率與精密度表

3 結論

本研究通過對液相色譜流動相、提取溶劑、凈化方式的優化，建立了超高壓液相色譜串聯四極桿質譜聯用儀測定雞蛋中氯霉素殘留的分析方法，該方法可有效減少基質干擾，降低溶劑的基質效應，增加氯霉素的提取率，提高氯霉素的回收率，保證方法的靈敏度和準確度。該方法操作簡便高效、精密度好，適用于大批量樣品雞蛋中氯霉素殘留量的檢測。