脫管散對大鼠壓力性損傷創面愈合及創面組織中TNF-α、IL-6表達的影響

戰 青,張樂樂,王 波,宋旭林,車 瑩

(甘肅中醫藥大學 護理學院,甘肅 蘭州 730000)

對于壓力性損傷(Pressure Injuries,PI)起源于拉丁語“decub”翻譯的褥瘡[1]及1873年James Pager[2]提出褥瘡定義;20世紀70年代提出“壓力性潰瘍”;2007年美國壓瘡咨詢委員會(National Pressure Ulcer Advisory Panel,NPUAP)提出壓力性損傷定義[3];2009年、2014年歐洲壓瘡咨詢委員會(European Pressure Ulcer Advisory Panel,EPUAP)與NPUAP聯合發布第1版和第2版《國際性壓瘡防治指南》[4-5];2016年NPUAP正式將“壓瘡”更名為“壓力性損傷”[6];至2019版《壓瘡/壓力性損傷預防和治療臨床實踐指南》[7],由于壓力性損傷患病率高,學術界從多學科、多層面對其進行研究與探索。最新研究顯示,美國每年有300萬成年人受該病困擾,住院患者中壓力性損傷總體患病率為5%～15%,重癥監護室和長期護理機構中患病率可能更高[8];我國一項多中心研究顯示:12家醫院的壓力性損傷患病率為1.58%,發病率為0.63%[9]。此外,壓力性損傷治療護理費用高,NPUAP估算每年僅用于壓力性損傷的治療費用高達110億美元,人均約3.8萬美元[10-11]。依據我國第七次人口普查數據,65歲及以上人口占比為13.50%[12];近15年人口調查數據顯示,我國65歲及以上老齡人口規模及比重正步入快速增長階段。老齡化的同時壓力性損傷發病率勢必增加,由此對人類健康和經濟造成的負擔不可小覷,急需尋求安全、有效、經濟的壓力性損傷防治方法。

脫管散是甘肅中醫藥大學附屬醫院院內制劑,是在“去腐生肌”“煨膿長肉”理論指導下,運用傳統經驗法,由輕粉、宮粉、麝香、枯礬、冰片5 味中藥配制而成,符合《中華人民共和國藥典》2020版散劑項各項規定,規格為每瓶1g,甘藥制字:Z04010880[13],在外科、骨科20多年瘡瘍破損、潰瘍、乳癰、臁瘡等較頑固疾病臨床應用中效果顯著[14]。在完成脫管散安全性與毒理分析前提下,以慢性難治性創面臨床觀察性研究和以急性創面為主的實驗研究已開展,但針對壓力性損傷作用機制的理論研究較為匱乏。本課題在前期研究基礎之上,通過動物實驗探討脫管散對大鼠壓力性損傷創面愈合及創面組織中TNF-α、IL-6表達的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級Wistar大鼠180只,雌雄對半,日齡70天左右,體質量180～250g,由甘肅中醫藥大學SPF級實驗動物中心提供,實驗動物生產許可證:SCXK(甘)2020-0001,實驗動物使用許可證:SYXK(甘)2020-0009。研究方案經甘肅中醫藥大學實驗動物倫理委員會審核通過,實驗過程中所有處置均符合2009版《EthicalIssuesAnimalExperimentation》中動物倫理學標準的有關條例。正式實驗開始前適應性飼養1周。

1.2 主要試劑與儀器

白凡士林(河南華凱生物科技有限公司);濕潤燒傷膏(汕頭市美寶制藥有限公司);脫管散(甘肅中醫藥大學附屬醫院藥劑科)。磁鐵:N35釹磁鐵,直徑(12±0.05)mm,厚(5±0.05)mm,質量2～4g,磁通量3 000高斯。TNF-α:一抗名稱為TNF-α(貨號:GB11188),一抗稀釋比1∶200;對應二抗名稱為CY3山羊抗兔(貨號:GB21303),一抗稀釋比1∶300。IL-6:一抗名稱為IL-6(貨號:GB11117),一抗稀釋比1∶200;對應二抗名稱為CY3山羊抗(貨號:GB21303),一抗稀釋比1∶300。抗體廠家:Servicebio。組化筆(Servicebio,型號:G6100);正置熒光顯微鏡(日本尼康,型號:Nikon Eclipse C1);成像系統(日本尼康,型號:Nikon DS-U3)。

1.3 分組與造模

使用隨機數字表從180只大鼠中分出30只為空白對照組,其余150只造模后再分組。借鑒Stadler I等[15]體外壓迫性I/R損傷造模方法,Peirce SM持續壓迫缺血2h、放松再灌注0.5h的時間分配方法[16],結合謝浩煌團隊深部壓力性損傷造模方法[17]進行綜合、改良,建造I/R損傷大鼠壓力性損傷模型。造模前12h禁食。具體操作步驟如下。

1.3.1 麻醉、備皮 根據大鼠體質量按照0.3mL/100g使用10%水合氯醛腹腔注射麻醉,剃除大鼠背部脊柱兩側50mm×40mm范圍內毛發并脫毛,溫水擦凈,0.5%碘伏消毒待干。空白對照組在相同造模部位備皮后不予造模。

1.3.2 放置磁鐵 以大鼠背部正中線為縱軸,大鼠前腿到后腿距離中線為橫軸,距離中線5mm在橫軸上標出2塊磁鐵吸附位置。縱行提起備皮區域皮膚,將2片滅菌后直徑12mm、厚5mm、質量2.4g、磁通量3 000高斯的圓形磁鐵對稱吸附于皮褶兩側產生40kPa壓力,壓迫局部造成缺血,2塊磁鐵之間間隔10mm皮膚橋,放回籠內自由活動,記錄當日第一循環缺血開始時間。壓迫磁鐵后為防止相互吸引所有模型大鼠單籠飼養。

1.3.3 移除磁鐵 壓迫2h后依次移除磁鐵,放回籠內自由活動0.5h,記錄當日第一循環再灌注開始時間,此為一個完整循環,即缺血2h,再灌注0.5h。每日循環4次。夜間持續壓迫12h至次日晨。連續壓迫4d。

1.3.4 造模成功標準 隨機選取2只造模后大鼠取創面組織行HE染色病理學檢測。鏡下見表皮、真皮以及皮下組織有不同程度損傷,表皮層以及真皮層有大量炎性細胞浸潤,皮膚附屬器消失,創面組織嚴重水腫、組織疏松,存在纖維變性及壞死。同時參照2016版《壓力性損傷分類系統》[6],3、4期表現綜合判斷造模成功。將150只模型大鼠隨機分為模型組、濕潤燒傷膏組、脫管散低劑量組、脫管散中劑量組、脫管散高劑量組共5組,每組30只。

1.4 處理措施

第4天夜間持續性壓迫之后開始給予各組相應處理措施。各組均按照無菌生理鹽水清潔創面或備皮區域→0.5%碘伏消毒創周、待干→用藥→包扎的流程處理。空白組備皮區域涂凡士林0.5g,模型組不進行藥物干預,濕潤燒傷膏組涂濕潤燒傷膏0.5g,脫管散低、中、高劑量組分別涂撒脫管散0.1g、0.2g、0.4g(以脫管散灑滿創面劑量即0.2g為中劑量組給藥劑量,將0.2g減半即0.1g為低劑量組劑量,將0.2g翻倍即0.4g為高劑量組劑量)。6組創面及備皮區域均覆蓋2層凡士林紗布、2層無菌紗布塊,外用自制裝置固定敷料,1次/d按時換藥。

1.5 各組創面愈合率觀察

使用分辨率2 376×1 080像素,攝像頭4 800萬像素+AF自動對焦的同一智能手機,鏡面與創面保持平行、間距15cm,相同焦距并在創面邊緣放已消毒刻度尺,拍攝大鼠用藥后第3天、7天、14天創面圖片。使用Image J圖像處理軟件測量創面面積,將測量數據導入Excel中,利用公式:創面愈合率(%)=(造模成功后創面面積-取材時創面面積)/造模成功后創面面積×100%,計算創面愈合率。為符合動物實驗設計盲法原則,對使用Image J軟件測量、記錄創面面積和計算創面愈合率(%)人員使用盲法。

1.6 各組創面組織TNF-α、IL-6表達的檢測

分別于用藥后第3天、7天、14天,各組隨機取10只大鼠麻醉后取下創面組織一側分為2部分,一部分使用4%多聚甲醛固定液固定,行HE染色、組織病理切片行組織病理學檢測,觀察組織壞死、炎性細胞浸潤、纖維細胞和毛細血管生長情況;另一部分采用免疫熒光技術(Immuno fluorescence,IF)檢測創面組織中TNF-α和IL-6表達水平,使用CaseViewer 2.4軟件打開光學顯微鏡下拍攝的不同時間點各組創面組織圖片,在400放大倍數下,采集不重疊視野、相同大小圖片,使用Image-Pro Plus圖像分析軟件對不同時間點各組創面組織所選視野下TNF-α、IL-6表達情況進行圖像分析,采用半定量方法計算出該視野下的平均光密度值(Average optical density,AOD)以估計TNF-α、IL-6的表達情況。將測量得出不同時間點各組創面組織中TNF-α、IL-6的熒光強度(Integral optical density,IOD)及像素點數量(面積,Area)導入Excel中利用公式計算:平均光密度值(AOD)=熒光強度(IOD)/像素點數量(Area)。為符合動物實驗設計盲法原則,對使用CaseViewer 2.4軟件采圖、Image-Pro Plus軟件測量和Excel計算平均光密度值的人員使用盲法。

1.7 統計學處理

2 結果

2.1 各組創面愈合率觀察結果

用藥后第3天、7天、14天,濕潤燒傷膏組和脫管散各組創面愈合率均高于模型組差異有統計學意義(P<0.05)。除用藥后第3天脫管散中劑量組無顯著優勢(P>0.05)外,在用藥后第3天、7天、14天脫管散低劑量組與濕潤燒傷膏組均可有效促進創面愈合且無顯著差異(P>0.05);脫管散低劑量組優于脫管散中、高劑量組(P<0.05)。說明在不同時間點,低劑量脫管散與濕潤燒傷膏均具有促進創面愈合,縮小創面面積,提高創面愈合率優勢,見表1、圖1。

表1 不同時間點各組創面愈合率

2.2 各組創面組織TNF-α、IL-6表達檢測結果

2.2.1 各組創面組織TNF-α表達檢測結果 除空白組外,其余各組TNF-α表達量在用藥后第3天、7天、14天均呈現先升高、后下降的“單峰”趨勢,高峰出現在用藥后第7天。模型組3個時間節點均高于其他各組差異有統計學意義(P<0.05);濕潤燒傷膏組3個時間節點均低于脫管散各組差異有統計學意義(P<0.05),其中用藥后第3天與脫管散低劑量組效果相當(P>0.05);脫管散各組3個時間節點抑制炎癥效果顯示,低劑量組優于中、高劑量組差異有統計學意義(P<0.05),見表2,圖2-圖4。

表2 不同時間點各組創面組織TNF-α表達量

2.2.2 各組創面組織IL-6表達檢測結果 除空白組外,其余各組IL-6表達量在用藥后第3天、7天、14天亦呈現先升高、后下降的“單峰”趨勢,高峰出現在用藥后第7天。模型組3個時間節點均高于其他各組差異有統計學意義(P<0.05);濕潤燒傷膏組3個時間節點均低于脫管散各組差異有統計學意義(P<0.05),其中在用藥后第3天、14天濕潤燒傷膏組低于空白組;脫管散各組3個時間節點抑制炎癥效果顯示,低劑量組優于中、高劑量組;用藥后第14天脫管散低劑量組明顯下降,相比于中、高劑量組與濕潤燒傷膏組更加接近,見表3,圖5-圖7。

圖1 不同時間各組大鼠用藥后創面大體情況觀察

圖2 IF檢測用藥后第3天各組創面組織TNF-α的表達(×400)

圖3 IF檢測用藥后第7天各組創面組織TNF-α的表達(×400)

表3 不同時間點各組創面組織IL-6表達量

圖6 IF檢測給藥后第7天各組創面組織IL-6的表達(×400)

3 討論

壓力性損傷是局部皮膚及軟組織長期受壓引起缺血缺氧、代謝障礙導致變性壞死的病理生理過程,其病理機制研究涉及領域較廣,被廣泛認可的有微循環障礙、細胞機械變形和I/R損傷三大學說。I/R損傷是引起慢性深部組織損傷的病理機制之一[16],主要與氧化應激、細胞凋亡和炎癥反應相關,其中氧化應激是核心因素。依據I/R損傷機制建造大鼠壓力性損傷模型,缺血時大量氧自由基蓄積,再灌注時蓄積氧自由基傾瀉而出,激活中性粒細胞、巨噬細胞等炎性細胞,產生大量炎性介質,使炎性細胞附著于血管壁,止血同時激活血小板分泌血小板源性生長因子(PDGF)、轉化生長因子(TGF-β)、表皮生長因子(EGF)等生長因子[18],以招募循環血液中炎性細胞介導炎癥反應并向創面趨化,促進角質形成細胞活化與遷移,還可分泌TNF-α吞噬病原微生物、清除創面壞死組織、產生促炎細胞因子[19]。因此,TNF-α被認為是I/R之后炎癥反應的關鍵性始動因子[20]。IL-6是一種多生物學活性細胞因子,除巨噬細胞外,內皮細胞、T細胞、成纖維細胞等也可產生。TNF-α和IL-6與炎癥反應密切相關,它們相互誘導共同參與了創面愈合全程[21]。對于創面愈合,炎癥反應是一把雙刃劍,正常炎癥反應有利于啟動局部和全身免疫系統,維持創面局部微生物水平與健康組織之間平衡[22],利于角質形成細胞增殖、分化與遷移,受壓部位血液循環重建,促進創面愈合;但過度和延長的炎癥反應會影響創面正常愈合,導致病理性瘢痕形成。已有研究證明[23-25],TNF-α與IL-6過度表達與創面遷延不愈密切相關。

本研究顯示,對各組創面大體觀察結果表明,濕潤燒傷膏組和脫管散各組均可促進壓力性損傷創面愈合,其中脫管散低劑量組與濕潤燒傷膏組在促進創面愈合方面效果相當。脫管散中、高劑量組劣于低劑量組,推測與脫管散的君藥輕粉相關。輕粉主要化學成分氯化亞汞(Hg2Cl2)經現代藥理研究證明[27]:毒性較低,僅能外用且需嚴格掌握適應證和劑量。姚昶等[26]研究表明,微量汞能激活免疫細胞活性,促進干擾素及炎性因子如白細胞介素等的產生,具有促進創面愈合之效。王斌[27]研究表明,在一定劑量范圍和觀察時間內脫管散對大鼠無嚴重毒性及皮膚刺激反應。王順義等[28]研究表明,過量輕粉會因刺激黏膜和蓄積作用引發毒性反應。

另外,除空白組外,在創面連續用藥第3天、7天、14天,各組創面組織TNF-α與IL-6表達均呈現先升高、后下降的“單峰”趨勢,高峰出現在用藥后第7天,推測脫管散在炎癥早期發揮“煨膿”功效,促進創面微生物及失活組織壞死,而外用脫管散和壞死組織作為抗原再次刺激創面放大炎癥反應,因而在炎癥晚期到增殖期伴隨壞死物質增多出現炎性因子表達高峰;在增殖期和重塑期發揮“長肉”功效,降低炎癥因子表達、抑制炎癥反應,因而在增殖期之后出現炎性因子表達降低的趨勢。表明伴隨創面愈合進展,脫管散對與I/R損傷密切相關的TNF-α與IL-6的表達具有雙向調節作用,即在創面愈合早期上調TNF-α與IL-6表達以啟動免疫反應、吞噬微生物及壞死組織為創面愈合營造良好微環境;創面愈合后期下調TNF-α與IL-6表達,促進創面由炎癥期向增殖期過渡,對促進壓力性損傷創面愈合具有一定優勢。

綜上所述,脫管散可以在創面愈合不同時期,通過雙向調節TNF-α與IL-6表達,調控創面炎癥反應,促進炎癥期向增殖期的順利過渡,避免創面遷延不愈。但本研究僅探索脫管散對創面愈合率和與I/R損傷密切相關的炎癥因子TNF-α和IL-6調控的影響,尚未從分子生物學角度探索脫管散促進創面愈合的分子機制,有待下一步深入探索。