加味補陽還五湯對術后腹腔粘連上皮-間充質轉化和纖溶平衡的影響

王亞楠,范文江,詹倩倩,鄭敏麟*

(1.福建中醫藥大學 中西醫結合研究院,福建 福州 350122;2.福建中醫藥大學中西醫結合學院,福建 福州 350122)

術后腹腔粘連(Postoperative abdominal adhesions,PAA)發生率高達90%以上,常發生在開腹手術后,PAA易導致慢性腹痛、腸梗阻、女性盆腔粘連而致不孕、增加再次手術難度等并發癥[1]。前期研究證實加味補陽還五湯能夠減少促纖維化因子-轉化生長因子-β1(TGF-β1)蛋白的表達,抑制TGF-β1/Smad纖維化信號通路的激活,對術后腹腔粘連有較好的治療作用[2]。本研究擬通過免疫組化法測定E-鈣黏蛋白(E-cadherin,E-cad)、波形蛋白(Vimentin)、組織型纖溶酶原激活劑(Tissue-type plasminogen activator,t-PA)、纖溶酶原激活劑抑制劑-1(Plasminogen activator inhibitor-1,PAI-1)、纖連蛋白(Fibronectin,FN)等蛋白在腹腔粘連模型大鼠的粘連處腸組織的表達情況,探討加味補陽還五湯防治術后腹腔粘連的可能作用機制,使其能更好地應用于臨床。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SD大鼠,性別為雄性,微生物級別為SPF級,數量為40只,年齡約為8周齡,體質量約(220±20)g,由福建中醫藥大學醫學實驗動物中心提供。許可號:SYXK(閩)2019-0007。大鼠正常活動,標準飼養環境(室溫20～22℃,相對濕度60%～65%),標準飼料喂養,自由飲水,適應性喂養1周。

1.2 實驗藥物

均購自福建中醫藥大學附屬第三人民醫院,加味補陽還五湯組成:黃芪100g、桃仁15g、紅花10g、川芎10g、當歸10g、赤芍15g、地龍干10g、五靈脂15g、蒲黃10g、土鱉蟲10g、炙甘草5g。用水提2次,每次1.5h,濃縮至稠膏狀,每毫升含原生藥21g。裝瓶存放于-20℃冰箱備用,用時水浴加熱至室溫。

1.3 實驗試劑與儀器

氯醛水合物(上海西格瑪-奧德里奇貿易有限公司,貨號:23100);透明質酸鈉粉劑(北京索萊寶科技有限公司,貨號:S8190)、伊紅染色液(北京索萊寶科技有限公司,貨號:G1100)、蘇木素染色液(北京索萊寶科技有限公司,貨號:G4530)、Masson三色染色試劑盒(北京索萊寶科技有限公司,貨號:1340);免疫組化試劑盒(博士德生物有限公司,貨號:SA1020)、DAB顯色試劑盒(博士德生物有限公司,貨號:AR1027);E-cad抗體(Chesion公司,貨號:CPA1199);Vimentin抗體(Proteintech公司,貨號:60330-1-lg);t-PA抗體(Abcam公司,貨號:ab157469);PAI-1抗體(Novus公司,貨號:NBP1-19773);FN抗體(Immunoway公司,貨號:YT1733);石蠟包埋機(孝感亞光醫用公司,型號:YB-7LF),石蠟切片機(LEICA公司,德國,型號:RM2235),搖床(海門麒麟醫用儀器廠,型號:TS-1),電子天平(上海精科天平公司,型號:JA3003),光學顯微鏡(尼康公司,日本,型號:ECLIPSE511)。

1.4 實驗分組及處理

按體質量給大鼠編號后,參照隨機數字表法,將40只雄性SPF級SD大鼠,每組10只,分為4組,組別及處理如下:①正常組:灌胃蒸餾水21mL/(kg·d);②模型組:灌胃蒸餾水21mL/(kg·d)+注射1mL生理鹽水;③加味補陽還五湯組(中藥組):灌胃加減補陽還五湯21mL/(kg·d)+注射1mL生理鹽水;④透明質酸鈉組(HA組):灌胃蒸餾水21mL/(kg·d)+注射1mL 1%透明質酸鈉凝膠。(注:中藥組灌胃劑量為臨床等效劑量)

正常組大鼠不進行造模。其余3組禁食但不禁水12h,參照參考文獻[2-4]方法制作術后腹腔粘連模型:采用腹腔注射4%水合氯醛(10mL/kg)的方式麻醉大鼠,備皮、消毒,開腹后取出盲腸置于無菌紗布上,用縫合線打活結以結扎回結腸系膜動脈2min后再松開,引起腸暫時性缺血。然后用無菌砂紙摩擦盲腸右側面漿膜(臟層腹膜)直至點狀出血,注意避開血管以免造成大量出血,放置20min,使漿膜干燥。用銼刀損傷相應位置的壁層腹膜,形成粗糙的出血表面。然后將盲腸按解剖位置放回,并讓臟層腹膜和壁層腹膜的傷口對齊,將兩個傷口部位彼此接近。HA組關腹前在造模部位注射1mL 1%透明質酸鈉凝膠,模型組、中藥組關腹前在造模部位注射等量生理鹽水,術后第2天,中藥組灌胃加味補陽還五湯,模型組、HA組灌胃等量蒸餾水。連續灌胃28d后取材。

1.5 觀察項目

1.5.1 鏡下觀察組織病理學變化 選取腸組織粘連部位制作石蠟切片,大鼠粘連腸組織固定、脫水、包埋。每塊蠟塊切6片后置于37℃烘箱過夜烤干,使用時二甲苯脫蠟、梯度乙醇脫二甲苯、蒸餾水水合后,3片行HE染色、3片行Masson染色(按相應說明書操作),顯微鏡下雙盲法觀察腸組織粘連處病理學改變情況。

1.5.2 免疫組織化學法測定腸組織粘連處E-cad、Vimentin、t-PA、PAI-1、FN蛋白的表達 石蠟切片脫蠟至水合后,按免疫組化試劑盒操作,所用一抗各自稀釋濃度為E-cad(1∶100)、Vimentin(1∶4 000)、t-PA(1∶200)、PAI-1(1∶200)、FN(1∶100),對粘連腸組織漿膜層E-cad、Vimentin、t-PA、PAI-1、FN蛋白的表達情況進行半定量觀察,采用Image-Pro Plus 6.0分析蛋白表達情況。

1.6 統計學分析

2 結果

2.1 病理學觀察結果

2.1.1 HE染色結果 正常組腸組織漿膜層結構完整,最外層腹膜間皮細胞(Peritoneal mesothelial cells,PMC)排列有序、連接緊密;模型組漿膜層有大量炎性細胞浸潤、纖維結締組織增生,PMC排列紊亂、連接松散;中藥組漿膜層散在炎性細胞浸潤,纖維結締組織較少,PMC排列較模型組有序、緊密;HA組少量炎性細胞浸潤,部分纖維結締組織增生,PMC排列較模型組有序、緊密。見圖1。

圖1 粘連腸組織HE染色(×400)

2.1.2 Masson染色結果 正常組腸組織漿膜層結構完整,最外層PMC排列整齊、連接緊密;模型組漿膜層有大量膠原纖維增生(深藍色),表示粘連程度較重,PMC排列紊亂、連接松散;中藥組漿膜層散在膠原纖維增生(淺藍色及淺紫色),表示粘連程度較輕,PMC排列較為有序、緊密;HA組漿膜層少量膠原纖維增生(淺藍色及藍色),粘連程度較模型組輕,PMC排列較為有序、緊密。見圖2。

圖2 粘連腸組織Masson染色(×400)

2.2 E-cad、Vimentin、t-PA、PAI-1、FN蛋白表達情況

2.2.1 E-cad、Vimentin表達情況 各組腸組織粘連處漿膜層E-cad、Vimentin蛋白表達結果:不同組別間,E-cad、Vimentin蛋白表達存在差異。正常組中E-cad高表達、Vimentin低表達。與正常組比較,模型組E-cad蛋白表達減少(**P<0.05),Vimentin表達增多(**P<0.05);與模型組比較,HA組和中藥組E-cad蛋白表達增多(##P<0.05),α-SMA、Vimentin表達減少(##P<0.05)。這一結果表明HA及加味補陽還五湯均能增加E-cad的表達,降低Vimentin的表達,抑制PMC發生上皮-間充質轉化(Epithelial to mesenchymal transition,EMT)。見圖3、表1、圖4。

表1 各組大鼠E-cad、Vimentin蛋白表達情況

注:a:與正常組比較**P<0.01,*P<0.05;b:與模型組比較##P<0.01,#P<0.05。

2.2.2 t-PA、PAI-1、FN的表達情況 各組粘連腸組織漿膜層t-PA、PAI-1、FN蛋白表達結果:不同組別間,t-PA、PAI-1、FN蛋白表達存在差異(均P<0.05)。正常組t-PA高表達,PAI-1、FN低表達。與正常組比較,模型組t-PA蛋白表達減少(**P<0.05),PAI-1、FN表達增多(**P<0.05);與模型組比較,HA組和中藥組t-PA蛋白表達增多(##P<0.05),PAI-1、FN表達減少(##P<0.05)。這一結果表明HA及加味補陽還五湯均能增加t-PA表達,降低PAI-1的表達,維持纖溶平衡,從而使FN表達降低,減少粘連。見圖5、表2、圖6。

表2 各組大鼠t-PA、PAI-1、FN蛋白表達情況

3 討論

術后腹腔粘連(PAA)是一種常于較大范圍的盆腹部手術后,發生率高達90%以上,易導致慢性腹痛、腸梗阻、盆腔粘連等并發癥的疾病[1]。

補陽還五湯合失笑散加土鱉蟲、炙甘草,即為加味補陽還五湯,是治療PAA的有效經驗方。本課題組認為,PAA因在腹部手術后,元氣大為虧損,氣虛無力推動血液運行而致血瘀,瘀久則入絡,故組方以補陽還五湯為主,大補術后虧虛之元氣、活血通絡;配伍專行腹部瘀血的失笑散而使其“補氣活血”之功專注于腹部,地龍干、土鱉蟲因其為蟲類長于通絡而逐瘀理傷,炙甘草調和全方諸藥,使補陽還五湯和失笑散兩方融為一體,專行腹部瘀血而擅治PAA。

圖5 各組大鼠腸組織漿膜層t-PA、PAI-1、FN蛋白表達情況 (免疫組化×400)

注:a:與正常組比較**P<0.01,*P<0.05;b:與模型組比較##P<0.01,#P<0.05。

腹膜為覆蓋在腹腔壁(壁層腹膜)及內臟器官(臟層腹膜)表面的漿膜,其主要成分為腹膜間皮細胞(Peritoneal mesothelial cells,PMC),是單層扁平的上皮細胞。PMC受到損傷時所發生的上皮-間充質轉化(Epithelial to mesenchymal transition,EMT)被認為是PAA發生的重要機制[5]。EMT是指在某些特殊生理或病理條件下,具有極性、連接緊密的上皮細胞轉化為具有運動能力以及連接松散間充質細胞的過程。

當受到創傷時,由PMC構成的壁層和臟層腹膜結構完整性遭到破壞,正常情況下會在接下來的5～7天完全修復[5],若腹膜受損嚴重,PMC會因無法及時修復而發生EMT,PMC(上皮細胞)形態發生肌成纖維樣改變(間充質細胞)并與周圍細胞連接松散,細胞中肌成纖維細胞標志物如α-SMA、I型膠原(Collagen-I)、Vimentin等表達也明顯增加。而上皮細胞標志物如E-cad、緊密連接蛋白1(ZO-1)等表達明顯下降;PMC原有的功能喪失,并且新生成的肌成纖維細胞會合成大量的膠原蛋白等結締組織,導致細胞外基質(Extra cellular matrix,ECM)沉積,引起粘連[5-6]。

正常情況下,纖溶酶可以將纖維蛋白(包括膠原蛋白和纖連蛋白)分解為纖維蛋白降解產物(Fibrin degradationproducts,FDP)而使纖維蛋白沉積物降解,則PAA不會發生。纖溶酶是被t-PA激活和被PAI-1抑制激活的,t-PA在正常情況下主要是由PMC分泌的,它與PAI-1共同維持纖溶平衡,避免FN等纖維蛋白沉積物過度沉積[7-9]。當PMC受到嚴重損傷時,不能發揮其原有功能,t-PA分泌減少,PAI-1相對增多,造成纖溶失衡,FN不能被有效降解,FN過度沉積,而FDP減少[9-10],形成粘連帶,導致永久性纖維粘連,則發生PAA。

本實驗研究表明,加味補陽還五湯能夠改善PAA大鼠腸組織粘連處的粘連情況,減少炎癥細胞浸潤,減少膠原纖維在漿膜層的堆積以減輕粘連,保護粘連處腸組織漿膜層PMC緊密連接的排列有序狀態。本實驗研究還表明,加味補陽還五湯可以降低粘連腸組織漿膜層PMC的Vimentin蛋白的表達,提高其E-cad蛋白表達,抑制漿膜層PMC發生EMT;同時,加味補陽還五湯還能降低漿膜層PAI-1蛋白表達,相應提高t-PA蛋白表達,維持纖溶平衡,從而減少FN蛋白表達,防止粘連的進一步形成,對術后腹腔粘連的防治起到良好的效果。本實驗對課題組前期研究[2]進行了補充,說明加味補陽還五湯對術后腹腔粘連的治療作用,可能是通過抑制漿膜層PMC發生EMT和改善纖溶失衡實現的。