補腎活血湯對去卵巢骨質疏松小鼠的干預作用研究:基于PI3K/AKT/mTOR信號通路

楊烙堅,周小海,劉力菠,鄺高艷,盧 敏

(1.湖南中醫藥大學第一附屬醫院,湖南 長沙 410007;2.湖南中醫藥大學,湖南 長沙 410208)

隨著老齡化的增加,我國患骨質疏松的中老年人逐漸增多[1]。骨質疏松(Osteoporosis,OP)是以骨密度減少、骨量降低、骨骼顯微結構退變為特征的一類病癥,會增加骨折風險[2]。與男性相比,絕經后婦女患骨質疏松概率較高,因此又被稱為絕經后骨質疏松[3]。卵巢功能退化、雌性激素水平下降是導致絕經后骨質疏松發生的主要原因[4]。雌激素替代法是防治絕經后OP的有效療法,但長期使用雌激素替代法會增加其他疾病的發生風險[5]。因此尋找不良反應較小的藥物是目前研究的熱點之一[6]。

中醫根據骨質疏松的癥狀,將其歸于“骨痹”“骨痿”的范疇[7],其病因病機為腎虛血瘀。研究表明,補腎活血類藥物對OP有明顯的治療效果[8],因此補腎壯筋、活血化瘀是治療骨痿的重要治則,目前已為臨床研究及實驗所證實[9-10]。補腎活血湯出自《傷科大成》,具有補腎壯骨、活血止痛之效。現代研究表明,補腎活血湯可廣泛應用于骨質疏松的治療,具有減少骨量丟失、調節骨代謝物水平等作用[11],其功效可能與調節骨的動態平衡有關。作為調節成骨細胞(Osteoblast,OB)、破骨細胞(Osteoclast,OC)功能的信號通路之一,磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)信號對維持骨結構的動態平衡有關鍵作用[12]。哺乳動物體內的雷帕霉素靶蛋白(mTOR)作為PI3K/AKT信號通路的下游因子,激活后調節細胞的增殖、分化、生長等過程,在自噬活性中起重要的調控作用[13]。PI3K/AKT/mTOR信號通路被證實與成骨細胞的增殖活動有關[14],但有關補腎活血湯與調節骨平衡的分子機制尚未闡明。

本研究基于PI3K/AKT/mTOR信號通路,探討補腎活血湯對去勢骨質疏松小鼠的影響,為補腎活血湯治療骨質疏松的作用機制研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 SPF級雌性SD小鼠40只,體質量(20±2)g,7周齡,購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司,動物許可證號SYXK(湘)2020-0010。實驗中對動物的處置符合國家科技部《關于善待實驗動物的指導性意見》的規定。小鼠按5只/籠飼養于湖南中醫藥大學東塘動物實驗中心SPF級動物房,環境溫度22～25℃,相對濕度40%～60%,晝夜交替,自由飲食,定期更換墊料。本動物實驗經湖南中醫藥大學實驗動物倫理審查委員會批準(批準號ZYFY20210925)。

1.1.2 藥材及制備方法 補腎活血湯方藥組成:熟地、補骨脂、菟絲子各9g,杜仲、枸杞、當歸、山萸肉、肉蓯蓉、沒藥、獨活各3g,紅花1.5g,均購于湖南中醫藥大學第一附屬醫院。參考文獻[15]所用方法,按人和小鼠劑量換算,計算出小鼠等效劑量為10.17g/kg,稱取補腎活血湯全方藥材混合,加入5倍量蒸餾水浸泡2h,先武火再文火煎1h,濾過;重復上述步驟,再次提取濾液,合并2次濾液,采用旋轉蒸發器濃縮至最終藥物質量濃度為1.017g/mL(以生藥量計),于4℃冰箱保存備用。

1.1.3 藥品與試劑 戊酸雌二醇片(補佳樂,生產廠家ELPHARM Lille S.A.S.,國藥準字J20171038);5%水合氯醛溶液(福州文萊生物科技有限公司,批號ST1002);4%多聚甲醛(北京蘭杰柯科技有限公司,批號BL539A);BALP ELISA試劑盒(武漢華美生物工程有限公司,批號O03038436);TRAP ELISA試劑盒(上海源桔生物,批號202202);伊紅染色液(Wellbio公司);蘇木染色液(Wellbio公司);PI3K抗體(美國proteintech公司,批號21890-1-AP);AKT抗體、mTOR抗體(美國CST公司,批號分別為4691S、2983S);β-actin(美國proteintech公司,批號66009-1-Ig);HRP標記的羊抗鼠抗體、HRP標記的羊抗兔抗體(美國proteintech公司,批號分別為SA00001-1、SA00001-2)。

1.1.4 儀器 臺式高速冷凍離心機(湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司,型號H1850);全自動酶標洗板機(深圳市匯松科技發展有限公司);多功能酶標分析儀(深圳市匯松科技發展有限公司);電熱恒溫培養箱(北京市永光明醫療儀器有限公司);微量移液器(德國艾本德儀器有限公司,型號Eppendof Research Plus 0.5～10μL);純水儀(英國Veolia公司,型號:RO33OBPM3);切片機(浙江金華益迪試驗器材);包埋機(常州中威電子儀器);骨密度儀(Hologic Discovery公司)。

1.2 方法

1.2.1 分組、造模與給藥 SD小鼠適應性飼養7 d后,隨機分為假手術組、模型組、西藥組(戊酸雌二醇0.205 5mg/kg)組以及補腎活血湯組,每組10只。除對照組外,其他組行卵巢切除術造模[16],小鼠5%水合氯醛溶液(0.35g/kg)麻醉,固定于手術操作臺,在小鼠背部正中兩側約0.5cm處行縱行切口,依次剪開皮膚、筋膜、肌肉及腹膜,進去腹腔,在脂肪堆積處找到卵巢,結扎并摘除雙側卵巢,分層縫合收口;對照組不摘除卵巢,只切除卵巢周圍同等質量的脂肪組織。術后禁食不禁水1d,戊酸雌二醇研碎后,用純凈水配制成質量濃度為0.020 55mg/mL的混懸液,術后1周開始干預,給予補腎活血湯和西藥組相應的藥物灌胃,對照組和模型組給予等體積0.9%氯化鈉溶液,1次/d,連續6周。

1.2.2 標本采集與處理 灌胃結束后1周進行取材,麻醉小鼠后經眼球取血,隨后將血液樣本放進離心機中離心30min,分離血清,-80℃冰箱中冷凍備檢。解剖小鼠雙大腿,分離雙側股骨,清除其周圍肌肉等軟組織,取雙側股骨并放在4%多聚甲醛里固定保存備檢。用于染色的骨組織在染色前,將骨組織從4%多聚甲醛中取出,于15倍量10%EDTA脫鈣液中脫鈣處理4周,每3天更換1次脫鈣液,至骨組織變軟(以使用針扎骨組織能夠順利刺入為準),脫鈣后以蒸餾水清洗,于乙醇溶液中固定。

1.2.3 ELISA檢測血清中BALP、TRAP含量 使用酶聯免疫吸附法(ELISA)檢測小鼠血清中BALP、TRAP 含量,依照 ELISA試劑盒說明書顯示的步驟依次操作。

1.2.4 補腎活血湯對去勢小鼠股骨骨密度的影響 將各組經 4%多聚甲醛固定的小鼠股骨拿出來后,先用紗布將股骨上面的多聚甲醛擦干,隨后在雙能X線骨密度分析儀上設置好編號,掃描類型填小動物,種族選項空白,區域高分辨率,并設置掃描長度,對小鼠股骨進行掃描,所得的骨密度值以單位面積骨礦物質含量(g/cm2)表示,最后對測得的骨密度值進行統計學分析。

1.2.5 補腎活血湯對去勢小鼠股骨病理變化的影響 股骨組織以10%甲醛固定,再用脫鈣液進行脫鈣,用二甲苯分別處理20min,3次,用常規乙醇梯度脫水,常規浸蠟、包埋后切片,進行蘇木素-伊紅(HE)染色,于顯微鏡下觀察股骨病理變化。

1.2.6 補腎活血湯對去勢小鼠股骨組織PI3K、AKT、mTOR蛋白表達的影響 股骨組織剪碎后,加入RIPA裂解液提取蛋白,勻漿后以4℃、12 000r/min 離心15min,取上清;測定蛋白濃度,制膠后,制備好的蛋白上清經電泳后,轉印至NC膜。 轉膜后于5%脫脂奶粉中室溫封閉90min,分別孵育PI3K(1∶1 000),AKT(1∶1 000),mTOR(1∶1 000),β-actin(1∶50 000)一抗于4℃孵育過夜。隔天洗膜后,室溫孵育辣根過HRP羊抗兔(1∶6 000)、HRP羊抗鼠(1∶5 000)二抗90min。洗膜后采用 ECL發光液成像系統檢測。

2 結果

2.1 補腎活血湯對去勢小鼠血清中BALP和TRAP水平的影響

模型組、補腎活血湯組血清中 BALP、TRAP 含量均高于假手術組(P<0.05),西藥物組血清中 BALP 含量高于假手術組(P<0.05),陽性藥物組血清中 TRAP 含量和假手術組無統計學差異(P>0.05);模型組血清中BALP、TRAP 含量符合骨質疏松癥的骨代謝特征,且均明顯高于補腎活血湯組和陽性藥物組(P<0.01);陽性藥物組血清中 BALP、TRAP 含量均低于補腎活血湯組(P<0.05)。見表1。

表1 小鼠血清中BALP和TRAP水平比較

2.2 補腎活血湯對去勢小鼠股骨骨密度的影響

與假手術組相比,模型組、西藥組、補腎活血湯組的骨密度均有所下降(P<0.05);西藥物組和補腎活血湯組的骨密度均高于模型組(P<0.05);西藥物組骨密度與補腎活血湯組無統計學差異(P>0.05)。見表2。

表2 小鼠股骨骨密度的比較

2.3 補腎活血湯對去勢小鼠股骨病理變化的影響

假手術組:骨皮質及骨松質部位完整,骨小梁結構緊密,基質染色均勻。模型組:可見骨皮質及骨松質有缺損,骨小梁數目減少,間隙增大,連續性中斷,結構稀疏,骨髓腔變寬,骨皮質變薄,基質染色嚴重減少,與骨質疏松癥的病理改變相符合。陽性藥物組:骨皮質及骨松質輕度缺損,基質染色輕度減少,骨小梁數量較模型組增多,結構改善,連續性尚可,骨皮質和假手術組基本接近。補腎活血湯組:骨組織染色情況與西藥物組大致相當。見圖1。

2.4 補腎活血湯對去勢小鼠股骨組織PI3K、AKT和mTOR蛋白表達的影響

與假手術組比較,模型組小鼠股骨組織PI3K、AKT和mTOR蛋白表達水平顯著降低(P<0.05);與模型組比較,補腎活血湯組和西藥組小鼠股骨組織PI3K、AKT和mTOR蛋白表達水平均顯著升高(P<0.05)。見表3。

圖1 小鼠骨組織的HE染色(倍數為10×10)

表3 小鼠骨組織PI3K、AKT和mTOR蛋白表達的比較

3 討論

骨質疏松屬于全身骨代謝疾病,其導致的骨脆性骨折是最嚴重的并發癥之一,常見于中老年人,尤以老年婦女為重。我國作為老齡化大國,骨質疏松發病率呈上升趨勢,威脅中老年人的健康,影響生活質量,增加致殘風險[1]。骨動態平衡失調是骨質疏松發生的重要原因,骨吸收速度大于骨的形成速度,致骨量減少、骨骼微結構破損、骨骼強度下降,增加骨折風險[17]。中醫將骨質疏松歸為“骨痹”“骨痿”,《素問·痿論篇》載:“腎主身之骨髓……骨枯而髓減,發為骨痿。”腎藏先天之精,主骨生髓,主一身骨骼的生長,《素問·上古天真論篇》記載:“女子七歲,腎氣盛……丈夫八歲,腎氣實……八八,則齒發去。”闡述骨的生長和發育依靠于腎精的滋養與推動,隨著人的衰老,腎精逐漸虛衰,骨髓生化乏源。脾為后天之本,主氣血之生化,先天不足可致后天失養,脾失健運,氣血生化失司,精血互化失常,精血無法資助骨骼,骨失所養。《醫林改錯》認為“血管無氣,必停留而瘀”,氣為血之帥,氣虛無力推動血液,血運遲緩,日久成瘀,瘀阻脈絡,最終形成腎虛血瘀之證,當治以補腎活血、化瘀止痛,代表方為補腎活血湯[18]。

補腎活血湯中杜仲、補骨脂補肝腎,強筋骨;當歸、紅花、沒藥、獨活補血活血,祛瘀止痛;肉蓯蓉、菟絲子、熟地黃、山茱萸、枸杞子補益肝腎,填補精血,諸藥共同發揮補腎強筋、活血化瘀、益氣壯骨之功。現代藥物研究表明,杜仲、補骨脂、獨活、枸杞子使破骨細胞分化減少,抑制骨吸收[19-20];熟地黃、菟絲子、紅花、沒藥、山茱萸對成骨細胞起保護作用,促進骨形成[21-25];當歸能減少骨質流失[26];肉蓯蓉改善骨代謝水平,具有抗骨質疏松功效[27]。有研究表明,補腎活血湯中活性成分可通過調控IL-6發揮抗炎作用,來改善骨質疏松的發生發展過程[28]。唐成劍等[29]通過CT掃描觀察骨小梁粗細,通過超聲檢測卵巢和子宮,并檢測檢查骨代謝,發現補腎活血湯可改善SD去勢大鼠骨骼CT指標,表明補腎活血湯可干預骨質疏松的進展。

血液里的生物化學指標可反映骨組織代謝,其中常見的生化指標包括骨堿性磷酸酶(BALP)和抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)。BALP是一種固定在成骨細胞和基質囊泡膜上的蛋白,能反映OB的活性[30]。BALP在礦化組織細胞中高表達,BALP增加無機磷酸鹽局部速率,促進礦化,產生羥基磷灰石晶體,在骨鈣化中起關鍵作用[31]。TRAP能反映OC活性程度,OC活性增加時其代謝水平會上升[32]。故TRAP與骨吸收有密切相關性,其表達在骨吸收的過程中升高,當骨形成期間其含量會明顯降低[33]。在骨基質中礦化物質的吸收過程中,TRAP的代謝水平與OC的活性呈正相關,反映了骨吸收的強弱[34]。本研究中,模型組能抑制BALP的分泌,提高TRAP產生的水平,而補腎活血湯能提高BALP的水平及抑制TRAP的產生,說明補腎活血湯可促進骨基質中的礦化,減少礦化底物降解。骨密度(BMD)是骨質量檢測的黃金指標[35],若骨密度過低則表明出現了骨質疏松。本研究中,模型組BMD較假手術組明顯下降,說明OVX小鼠骨量丟失,補腎活血湯組BMD較模型組升高,說明補腎活血湯使OVX小鼠骨量丟失減少。

PI3K/AKT/mTOR信號通路是調節骨質疏松的信號通路之一,其與OB和OC的凋亡與增殖有密切關系[36]。PI3K通過催化磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸生成PIP3,激活下游信號Akt的磷酸化,從而激活其下游的mTOR,PI3K/AKT/mTOR信號通路激活不同的效應分子,進而調節細胞的凋亡與增殖[37]。張豐姣等[38]研究發現,二甲雙胍通過激活PI3K/AKT/mTOR信號通路對線粒體起保護作用,從而抑制OB的凋亡。有研究表明,白藜蘆醇可通過激活PI3K/Akt/mTOR通路調節線粒體吞噬,能有效抑制地塞米松處理過的OB凋亡,同時減少OC分化,達到治療骨質疏松的目的[39]。本研究中,OVX小鼠下調PI3K、AKT、mTOR表達水平,而西藥組及補腎活血湯組均上調了PI3K、AKT、mTOR表達水平,說明補腎活血湯可通過激活PI3K/AKT/mTOR信號通路來調節骨質疏松。

綜上所述,補腎活血湯有抗骨質疏松的作用,其作用機制可能與PI3K/AKT/mTOR信號通路激活有關。然而,PI3K/Akt/mTOR信號通路在成骨及破骨中的調控機制十分復雜,補腎活血湯治療骨質疏松的具體分子機制還需進一步探究。