基于化學(xué)計(jì)量方法甘松藥材不同采收期揮發(fā)油及指紋圖譜差異性評價(jià)

王繼強(qiáng),王二歡,楊祎辰,馬存德,劉騰恬,安 莉,李 婷,王 慧,劉 峰*

(1.陜西國際商貿(mào)學(xué)院 中藥研究院,陜西 咸陽 712046;2.陜西步長制藥有限公司,陜西 西安 710075)

甘松來源為敗醬科甘松屬植物甘松NardostachysjatamansiDC.的干燥根及根莖[1],別名甘松香,性味辛,甘,溫,歸脾胃,有理氣止痛,開郁醒脾的功效,為我國二級保護(hù)藏藥。對其記載最早見于《本草拾遺》[2],《海南本草》和《開寶本草》等也有記載。甘松多分布于喜馬拉雅山脈南北兩側(cè),主產(chǎn)于我國四川、甘肅、青海等地以及印度北部、尼泊爾[3]。品種劃分中將其分為甘松、匙葉甘松Nardostachysjatamansi(D.Don) DC、大花甘松NardostachysgrandifloraDC,有學(xué)者認(rèn)為甘松、匙葉甘松、大花甘松之間為性狀過渡[4],均為同一種植物。

甘松有效成分研究中,多集中在揮發(fā)油成分方面[5]及非揮發(fā)性成分的環(huán)烯醚萜類、單帖、倍半萜、二萜、三萜、黃酮類等方面,其中萜類化合物為主要活性成分[6]。馮海生等[7]研究甘松不同來源不同生長發(fā)育階段成分的動態(tài)變化,耿曉萍等[8]分析甘松不同部位揮發(fā)油化學(xué)成分對比研究及甘松新酮的提取工藝優(yōu)化,表明不同階段成分含量存在差異。劉國林等[9]通過測定黃酮及甘松新酮等物質(zhì)評價(jià)海拔高度對甘松有效成分含量的相關(guān)性分析,結(jié)果表明總黃酮與甘松新酮與海拔高度具有一定相關(guān)性;伍杰等[10]研究分析不同產(chǎn)地甘松揮發(fā)油、甘松新酮、綠原酸、灰分、微量元素等指標(biāo)的檢測,表明其質(zhì)量差異與生長環(huán)境密切相關(guān)。張宇霞等[11]依托高原生物研究所,論述不同采收期、不同產(chǎn)地甘松揮發(fā)油及浸出物存在較大的差異;買吾蘭江·買提努爾等[12]開發(fā)甘松指紋圖譜及甘松新酮色譜測定技術(shù),楊祎辰等[13]采用Box-Benhnken響應(yīng)面法提取優(yōu)化甘松揮發(fā)油的提取方法。李瑩[14]采用色譜技術(shù)評價(jià)甘松藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的初步研究;張毅[15]采用現(xiàn)代技術(shù)評價(jià)化學(xué)成分的抗腫瘤活性化合物的合成及構(gòu)效關(guān)系;李艷忙等[16]對其研究結(jié)果進(jìn)行論述。

近年來隨著研究深入,甘松有效成分測定也逐步標(biāo)準(zhǔn)化,2015版及后續(xù)《中華人民共和國藥典》增加有效成分甘松新酮含量測定,尤其隨著近年來產(chǎn)區(qū)政策影響,甘松藥材肆意采挖,產(chǎn)量逐漸下降,各地區(qū)藥材質(zhì)量差異較大,難以把控品質(zhì)。尤其在市場交易中,甘松多為全草入藥,鮮有全根,為此,本研究以甘松栽培原材為樣品,通過對不同部位不同采收期揮發(fā)油的測定及建立有效成分的指紋圖譜全方位評價(jià),探討其動態(tài)變化過程及市場流通的合理性,對建立甘松藥材種植技術(shù)質(zhì)量評價(jià)體系提供一定的依據(jù),詮釋人工種植以及不同部位入藥的可行性。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

島津2030Plus液相色譜儀(日本島津);TE124S分析天平(德國Sartorius公司);DHG-9050B智能型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上?，槴\實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司);KQ-800KDE高功率數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);TQ-500高速多功能粉碎機(jī)(上海市天祺盛世科技有限公司);98-I-BN電熱套(天津市泰斯儀器有限公司);揮發(fā)油提取裝置(上海壘固儀器有限公司);乙腈、甲醇、異丙醇(色譜純,德國MERCK公司);甲醇、無水乙醇、磷酸(分析純AR,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);甘松新酮(AF21021603)、綠原酸(AF21012553)、蒙花苷(批號:AZ21091601)、隱丹參酮(批號:AF20092606),均來自成都埃法生物科技有限公司。

1.2 試驗(yàn)材料

于2022年3月-2022年10月,在步長制藥甘肅藥源基地采收甘松不同部位(根及根莖、莖葉、全草)樣品,陰干后保留備用,采用仿野生栽培技術(shù),引種馴化并采用分株繁殖方式種植完成生長周期,經(jīng)陜西步長制藥有限公司主任藥師馬存德鑒定為敗醬科甘松屬植物甘松NardostachysjatamansiDC.,詳見表1。

表1 樣品批次編號

2 試驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1 揮發(fā)油提取測定

試驗(yàn)樣品陰干后打粉過3號篩,參考2020版《中華人民共和國藥典》四部通則2204甲法,采用水蒸氣蒸餾法提取揮發(fā)油,粒徑527μm,料液比1∶10(g∶mL),提取6h,經(jīng)無水硫酸鈉干燥后,揮發(fā)油顏色為淺綠色至淡黃色油狀,含有特殊香味。

2.2 色譜條件

色譜柱:Diamonsil Plus 5μm C18-A,250mm×4.6mm;島津2030 Plus高效液相色譜儀;流動相:乙腈(A)-0.2%磷酸溶液(B);柱溫:30℃;流速:1.0mL/min;進(jìn)樣量:10μL;波長275nm,洗脫條件見表2。

表2 梯度洗脫條件

2.3 對照品溶液制備

精密稱取甘松新酮對照品適量,加甲醇制成每1mL中0.50mg溶液;精密稱取綠原酸、蒙花苷、隱丹參酮對照品適量,加甲醇分別制成每1mL中含0.25mg的溶液,于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4 樣品溶液的測定

精密稱取甘松不同采收期藥材粉末(過3號篩)1.00g,置于三角瓶中,以甲醇為溶劑,料液比1∶10,室溫超聲(800W,60kHz)提取60min,取上清液適量按照“2.2”方法,進(jìn)行色譜測定,得甘松樣品期不同部位指紋圖譜及混合對照品圖譜,見圖1、圖2。

圖1 甘松不同采收期不同樣品指紋圖譜

圖2 甘松對照品圖譜

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 精密度試驗(yàn) 精密吸取甘松溶液,在“2.2”色譜條件下,連續(xù)進(jìn)樣6次,以12號峰甘松新酮為參照峰,計(jì)算相對保留時(shí)間以及相對峰面積RSD值,結(jié)果表明各批次15個(gè)共有峰相對保留時(shí)間RSD為0.03%～0.46%,相對峰面積RSD為0.17%～1.45%。

2.5.2 重復(fù)性試驗(yàn) 按照“2.4”下平行稱取甘松樣品6次制成供試品溶液進(jìn)行色譜測定,以12號峰甘松新酮作為參照峰,計(jì)算相對保留時(shí)間及相對峰面積的RSD值,結(jié)果表明各批次15個(gè)共有峰的保留時(shí)間RSD為0.13%～1.04%,相對峰面積RSD為0.22%～1.28%。

2.5.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取甘松供試品溶液,在“2.2”項(xiàng)色譜條件下,分別在0h、4h、8h、16h、20h、24h、48h進(jìn)樣,以甘松新酮為參照峰,計(jì)算相對保留時(shí)間及相對峰面積的RSD值,結(jié)果表明各批次15個(gè)共有峰的保留時(shí)間RSD為0.10%～1.28%,相對峰面積RSD為0.18%～2.02%。

2.5.4 線性考察 用甲醇稀釋甘松對照品溶液甘松新酮,分別為原濃度的1、1/2、1/4、1/8、1/16、1/32倍,搖勻,經(jīng)0.22μm濾膜過濾。在“2.4”項(xiàng)條件下,以對照品含量(mg/L)為橫坐標(biāo)X,測得的峰面積積分值為縱坐標(biāo)Y,分別建立甘松新酮及綠原酸回歸方程:Y=317.86X+1.913 4,R2=0.999 9;Y=37.372X+36.92,R2=0.999 9。

2.5.5 線性考察 用甲醇稀釋對照品溶液,分別為原濃度的1、1/2、1/4、1/8、1/16、1/32倍,搖勻,經(jīng)0.45μm濾膜過濾,備用。在“2.2”項(xiàng)條件下,以對照品含量(mg/L)為橫坐標(biāo)X,測得峰面積積分值為縱坐標(biāo)Y,建立甘松新酮回歸方程:Y=317.86X+1.913 4,R2=0.999 9。

2.6 數(shù)據(jù)處理

將不同采收期甘松樣品色譜圖導(dǎo)入“中藥指紋圖譜相似度度軟件評價(jià)系統(tǒng)(2012.130723)”進(jìn)行指紋圖譜相似度評價(jià),采用SPSS 26.0軟件進(jìn)行顯著性差異分析、聚類分析以及主成分分析。

2.7 化學(xué)計(jì)量學(xué)分析

2.7.1 不同采收期揮發(fā)油含量差異分析 對不同采收期不同部位甘松揮發(fā)油含量進(jìn)行非參數(shù)檢驗(yàn),采用傅萊德曼雙向按秩方差分析,在顯著性水平0.05下做雙側(cè)檢驗(yàn),顯著性水平為0.03,存在顯著性差異,揮發(fā)油含量最高為8.5%,最低為1.1%,皆為9月份樣品,3月份全草高于根及根莖,7月份莖葉高于全草,其余月份為根及根莖大于全草大于莖葉;采用中位數(shù)進(jìn)行聚類分析平方歐式距離,將其分為兩類,9月份為一類,其余月份為二類,見圖3;除5月、9月莖葉外,其余采收期揮發(fā)油含量都符合藥典規(guī)定。

圖3 甘松揮發(fā)油差異分析及聚類分析

2.7.2 不同采收期甘松不同部位HPLC指紋圖譜建立 采用“中藥指紋圖譜相似度度軟件評價(jià)系統(tǒng)(2012.130723)”分別對甘松不同采收期不同部位指紋圖譜進(jìn)行共有峰確定以及相似度評價(jià),采用平均數(shù)法,經(jīng)峰匹配后生成對照圖譜R,見圖1,甘松不同采收期不同部位樣品HPLC圖譜相似度結(jié)果見表3。

結(jié)果表明甘松不同采收期不同部位24批次樣品中,在15個(gè)共有峰下,第2號峰為綠原酸,第6號峰蒙花苷,第12號峰為甘松新酮,15號峰為隱丹參酮,相似度范圍在0.500～0.993之間;其中莖葉的相似度為0.500～0.986,根及根莖的相似度為0.586～0.994;全草相似度為0.533～0.992;根及根莖的相似度高于全草、莖葉。共有峰面積介于34.89%～74.79%,其中根及根莖為47.96%～74.79%,顯著高于全草與莖葉。

表3 相似度數(shù)據(jù)

2.7.3 聚類分析及主成分分析 以甘松不同采收期不同部位共有峰峰面積為基準(zhǔn),導(dǎo)入SPSS 26.0分析軟件,對其進(jìn)行綜合評價(jià),采用中位數(shù)聯(lián)結(jié),歐式平方距離為分類標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行系統(tǒng)分類;聚類分析結(jié)果見圖4,聚類分析將其1～15共有峰分為3類,其中,2號峰、12號峰單獨(dú)分為第一類、第二類、其余共有峰為第三類,由此可知,其特征峰2號綠原酸與12號甘松新酮為甘松藥材的主要成分具有合理性,與相似度評價(jià)具有一致性。

圖4 聚類分析及碎石圖

在聚類分析基礎(chǔ)上,以各批次共有峰峰面積為基礎(chǔ)進(jìn)行主成分分析,其碎石圖見圖4,特征值及其累計(jì)方差貢獻(xiàn)率見表4,以特征值>1為標(biāo)準(zhǔn),共確定3種主成分,累計(jì)貢獻(xiàn)率為87.794%,能夠較好體現(xiàn)其成分特征;對主成分載荷值進(jìn)行主成分計(jì)算的綜合評價(jià)見表5,綜合得分高低代表藥材品質(zhì)的差異,表明不同采收期對其影響較大;以3個(gè)主成分為基準(zhǔn)得到主成分載荷圖見圖5,峰2(綠原酸)有較大的權(quán)重比,峰12(甘松新酮)落在第3主成分,峰15(隱丹參酮)落在第1主成分,表明在不同批次中成分相對穩(wěn)定;從表5中可以看出,甘松不同采收期主成分綜合得分評價(jià)中根及根莖優(yōu)于全草優(yōu)于莖葉,其中3月份樣品中根及根莖的綜合得分最高,其次為3月全草、9月根及根莖,由此可知,3月采收藥材綜合評價(jià)最優(yōu)。

表4 主成分特征值及貢獻(xiàn)率

表5 不同采收期主成分因子及綜合評價(jià)

圖5 主成分分析

3 討論

本試驗(yàn)采用中藥指紋圖譜技術(shù)結(jié)合化學(xué)計(jì)量分析方法,在市場藥材流通及產(chǎn)地分布、資源蘊(yùn)藏量調(diào)研前提下,開展甘肅產(chǎn)地甘松栽培藥材采收期試驗(yàn)研究,測定甘松揮發(fā)油含量。采用聚類分析、顯著差異評價(jià)不同采收期揮發(fā)油動態(tài)變化規(guī)律;采用傅萊德曼雙向按秩方差分析進(jìn)行揮發(fā)油的顯著性分析,在顯著性水平0.05下做雙側(cè)檢驗(yàn),顯著性水平為0.03,聚類分析中分為兩類,其中9月份單獨(dú)為一類。同時(shí)結(jié)合HPLC相似度評價(jià)及化學(xué)計(jì)量分析方法能夠更好體現(xiàn)數(shù)據(jù)模型的合理性。

在對干松不同采收期不同部位指紋圖譜評價(jià)過程中,根據(jù)研究目的,建立不同采收期HPLC指紋圖譜,對其進(jìn)行聚類分析、主成分分析,在極大程度上反映甘肅產(chǎn)區(qū)甘松樣品品質(zhì)的穩(wěn)定性;由此可知,在不同采收期中,主成分種類具有一致性,相對含量隨著季節(jié)不同有所變化,其中地下部分相對含量高于全草,高于莖葉;共有峰面積占比為47.96%～74.79%,主成分分析中3個(gè)主成分累計(jì)貢獻(xiàn)率為87.793 75,主成分因子綜合評價(jià)評價(jià)中根及根莖>全草>莖葉,可以客觀反映藥材品質(zhì)的整體性與差異性。

不同采收期共有峰峰面積變化趨勢與植物生長量、物質(zhì)轉(zhuǎn)移等具有相關(guān)性,不同部位之間揮發(fā)油變化差異有一致性,揮發(fā)油含量最高為9月份,有效成分含量主成分分析最佳為3月份,綜合當(dāng)?shù)貧夂颦h(huán)境及采收成本問題以春季3月土地解凍后采收最佳。

樣品采集方法中,以植物生長周期為基準(zhǔn),從出苗期到枯萎期,夏季綠原酸含量不斷增加,初春及秋末甘松新酮含量較高且趨勢明顯,其中10月末由于環(huán)境原因成分出現(xiàn)分解現(xiàn)象,這一變化趨勢與氣候等自然因素有關(guān)外還有待進(jìn)一步研究,次生代謝產(chǎn)物積累規(guī)律中,由于栽培技術(shù)不成熟,葉冠比、根的分支等與野生差異較大,尚未全面推廣。市場中甘松藥材多為全草入藥,少有全根,本試驗(yàn)以甘肅產(chǎn)區(qū)栽培品為樣品論述不同采收期不同部位入藥的合理性及差異性,表明全草入藥具有可行性,為其資源評價(jià),綜合開發(fā)利用,藥材穩(wěn)定性提供研究基礎(chǔ)和方法,為優(yōu)質(zhì)甘松藥材栽培提供可行的參考與依據(jù)。