基于質譜成像可視化表征甘草飲片主要化學成分組織分布

熊田田,羅世英,裴照卿,唐 策,3*

(1.成都中醫藥大學 藥學院,四川 成都 611137;2.成都中醫藥大學 中醫藥創新研究院,四川 成都 611137;3.成都中醫藥大學 民族醫藥學院,四川 成都 611137)

甘草為豆科植物甘草GlycyrrhizauralensisFisch.、脹果甘草G.inflataBat.或光果甘草G.glabraL.的干燥根和根莖,具有補脾益氣、祛痰止咳、清熱解毒、緩急止痛、調和諸藥的功效[1-2]。《神農本草經》將甘草列為上品,在中藥組方中常配伍使用,起到調和藥性的作用,素有“十方九草”之美譽。甘草主要包括甘草素等黃酮類、甘草酸等皂苷類、香豆素類、多糖類等成分,其中黃酮類和皂苷類含量較高[3]。現代藥理學研究表明,甘草具有抗氧化、抗癌、神經保護、鎮咳、抗抑郁等多種藥理活性。

甘草化學成分較多且成分復雜,目前關于甘草成分定性、定量分析研究主要為高效液相色譜(HPLC)、超高效液相色譜-串聯四級桿飛行時間質譜(UPLC-Q-TOF/MS)、超高效液相色譜-三重四級桿串聯質譜(UPLC-QQQ-MS)等,質量評價多側重于多個成分的含量測定。盡管甘草在植物化學和藥理作用等方面已有較多研究,但其在空間代謝物的報道還較少,因為采用上述方法打粉提取后,其空間代謝物相關信息被破壞或丟失。質譜成像(Mass spectrometry Imaging,MSI)技術是一種基于質譜分析,對待測樣品進行多點檢測、多維數據獲取及可視化,實現多分子水平、多分子種類、高靈敏度同時檢測并顯示其空間分布的分子成像技術,不需要基質涂抹的常壓原位電離質譜分析技術,可通過特定成像軟件進行質譜數據分析,從而清晰直觀地反映出待測分子在天然藥物中的組織分布。質譜成像技術既操作簡便、又保證了被分析物的原位空間性和準確性,已廣泛應用于醫藥、工業、食品、生物學等行業[4-6]。

本研究采用具有實時、在線、原位、高通量等特點的解吸電噴霧電離質譜成像(DESI-MSI)技術,對甘草飲片中的化學成分進行快速、全面的定性分析,對甘草根莖主要化學成分組織分布,進行100μm的空間分辨率可視化表征,為甘草次生代謝產物的生物合成和積累提供重要信息。

1 儀器與試藥

Waters Snapt QTof質譜儀(美國Waters公司);DESI-MSI質譜成像系統(美國Waters公司);移液槍(美國Thermo Scientific公司)。HPLC級甲醇(美國Sigma-Aldrich公司),HPLC級甲酸(美國Thermo Fisher 公司),亮氨酸腦啡肽(美國Waters公司),Milli-Q純凈水。藥材收集于四川省成都市荷花池藥材市場,經唐策副教授鑒定為甘草GlycyrrhizaeRadixetRhizoma的根及根莖。

2 方法

2.1 供試品DESI-MSI分析

在具有解析電噴霧的SNAPT TOf質譜儀上,掃描收集甘草的化學成分。通過高電壓加于N2輔助的電噴霧溶劑上形成帶電噴霧液滴,并直接噴射于樣品上,帶電溶劑與待分析物作用發生離子化,形成二次帶電液滴,在表面收集離子和中性分子,最后轉移至質譜檢測器創建質譜圖像,并構建2D圖像。使用高清晰度成像(HDI)軟件創建圖像,參數設置如下:X和Y像素大小為100μm;光柵速度300μm/s;噴霧溶劑由90%甲醇、10%水、0.05%甲酸和0.1mmol/L亮氨酸腦啡肽組成,溶劑流速為2μL/min,在負離子模式下進行質譜掃描,毛細管電壓4.5kV,錐孔電壓80V,m/z100-1 600。以產生原始MS文件創建MS圖像,LE(m/z554.2615)用于校正高分辨率。

2.2 數據處理

將MS原始數據文件導入HDI V1.5軟件(美國Waters公司)查看圖像。通過數據庫查找有關甘草化學成分的文獻獲得有關成分化學名及分子式,運用Mass Lynx V4.2(美國Waters公司)計算相對質量及質譜所得的離子碎片相對質量與計算得出的相對質量偏差進行鑒定。

3 結果

對鑒定出的甘草主要成分組織分布可視化圖像進行分類歸納,其中,黃酮類22種、三萜類5種和其他類1種,甘草根莖組織橫切面分為皮層、韌皮部、形成層、木質部、髓部5個部位,見表1和圖1。

表1 甘草主要化學成分

3.1 黃酮類成分在甘草橫切面的空間分布

對比分析甘草根莖中主要黃酮類成分的圖像,按如下方法鑒定了22種主要成分。m/z549.162 0經過Mass Lynx V4.2軟件擬合得出分子式為C26H29O13,其中ppm為2.2,結合離子信號強度和所建成分數據庫推測圖m/z549.162 0是成分芹糖甘草苷/芹糖異甘草苷(21)的組織分布圖,其余成分同理推測。

經歸納總結出,甘草素/異甘草素(2)在形成層和髓部分布較多,韌皮部和木質部次之;懷特酮/黃甘草異黃酮(8)、甘草異黃酮乙(11)、異甘草黃酮醇(12)、甘草香豆素(15)、新烏拉爾醇/烏拉爾醇(16)、Kanzonol(17)、甘草利酮(18)芹糖甘草苷/芹糖異甘草苷(21)主要分布在韌皮部和木質部,在髓部幾乎無分布;高紫柳查爾酮(5)、紅車軸草素/異山柰素(6)、光甘草酮/異光甘草酮(7)、甘草查耳酮A/C/E/4′-O-甲基光甘草定(9)、Corylifol B(10)、3-羥基光甘草酚/脹果甘草寧A(19)分布不均勻;Angustone A/Isoangustone A(20)在髓部幾乎無分布,在皮層分布較多,其余部位分布均勻;異佛萊心苷(22)主要分布于韌皮部、木質部、髓部,在形成層幾乎無分布。

成分熊竹素B(1)、三羥基異黃酮(3)、柚皮素查爾酮(4)、粗毛甘草素C(13)、Hirtellanine I(14)含量極少,離子信號較弱,為了使成分分布更清晰可觀,可以將最大信號強度再調小一些。

3.2 三萜類成分在甘草橫切面的空間分布

對比分析甘草根莖中主要三萜類成分的圖像,鑒定了5種主要成分。成分m/z821.398 4經過Mass Lynx V4.2軟件擬合得出分子式為C42H61O16,其中,ppm為2.9,結合離子信號強度和所建成分數據庫推測圖m/z821.398 4是成分甘草酸/烏拉爾甘草皂苷B/甘草皂苷H2/K2(24)的組織分布圖。成分甘草皂苷B2(23)、甘草酸/烏拉爾甘草皂苷B(24)、甘草皂苷J2(25)、甘草皂苷G/羥基甘草酸(26)、甘草皂苷A3(27)主要分布在韌皮部和木質部,形成層和髓部分布次之。

圖1 甘草主要化學成分成像

3.3 其他類成分甘草橫切面的空間分布

對比分析甘草根莖中主要其他類成分的圖像,鑒定了1種主要成分Glicophenone(28),其含量較少,在髓部幾乎沒有分布,其余部位分布不均勻。

4 討論

盡管DESI-MSI出現時間不長,但近年來其在植物成分分析方面的應用證實,DESI-MSI在植物成分空間分布的研究前景廣闊,如鉤藤三種生物堿分布研究,運用此技術對不同生長階段鉤吻植物不同部位的成分分布進行成像分析[9];紅果樫木種子生物堿分布研究,運用此技術對紅果樫木種子進行成像分析,得出發育過程黃酮類生物堿積累的動態規律[10];附子的成分分布研究,運用此技術對附子生品和加工品進行成像分析,得出不同蒸制時間點的化學成分分布規律[11]等。

甘草中成分復雜,其成分常含有大量同分異構體,本研究僅對樣本的一級結構進行了分析,同分異構體對分析結果存在一定影響。部分成分在樣本上分布不均勻,影響了分析結果的直觀性,而LI等[12]對甘草質譜成像的研究則證明質譜成像技術在甘草根莖成分分布研究的可行性。

本研究運用DESI-MSI技術對甘草根莖主要化學成分的空間分布進行了研究,共鑒定出28種化學成分,并對其在皮部、髓部等不同微區的分布進行了成像,得到了28種化學成分的組織分布情況。甘草黃酮類成分具有抗氧化、抗腫瘤、抗病毒、抗炎、抑菌、保肝等作用,其治療心臟疾病、糖尿病等也具有一定藥用價值,近年來其更是在各類護膚品中有所應用[13-14],甘草三萜類成分也有抗氧化作用[15]。不同成分對人體作用不同,各類成分在空間上的分布規律有利于目標成分研究。對甘草根莖中成分的空間位置進行成像研究,不僅有利于理解、掌握甘草中特定成分的分布規律和體內生物合成,還可結合甘草代謝物在動物組織切片中的分布,明確藥效成分及作用靶點,亦可以對甘草炮制前后的成分變化進行分析,找出增效減毒最大化的炮制方法。本研究為甘草主要化學成分空間分析提供了新信息,對豆科植物黃酮和皂苷的生物合成途徑研究可資借鑒,進一步證明該技術可為植物中代謝物進行高通量分析提供新方法,且DESI-MSI對甘草成分的空間成像分析,也為其他中藥材研究提供了參考和技術支撐,應用前景廣闊。