微量殘留病監測在ETV6/RUNX1陰性和陽性急性B淋巴細胞白血病患兒預后中的意義

劉俊閃 郭明發 孫 佳 史利歡 劉 煒 段勇濤

（1. 鄭州大學附屬兒童醫院河南省小兒血液醫學重點實驗室，河南 鄭州 450000；2. 鄭州大學附屬兒童醫院血液腫瘤科，河南 鄭州 450000）

急性B淋巴細胞白血病（acute B-lymphoblastic leukemia，B-ALL）是一種常見的兒童白血病，嚴重威脅患兒健康和生命[1]。目前，兒童急性淋巴細胞白血?。╝cute lymphoblastic leukemia，ALL）的治療方案以化療和造血干細胞移植為主，復發是治療失敗的最主要原因。微量殘留?。╩inimal residual disease，MRD）是指惡性血液系統疾病經治療后雖然達到臨床緩解，但血液中仍殘存微小比例白血病細胞的狀態[2-3]，隨著治療的持續進行，殘留的細胞可能會逐步減少，直至完全消失。MRD是疾病復發的隱患，持續監測MRD是評估惡性血液系統疾病患者預后的重要措施。由于MRD呈動態變化，不同時間點的MRD數值反映的預后意義不同[4-5]。有研究發現，對于不同融合基因背景的ALL患兒，MRD狀態及其代表的預后意義有一定差異[6]，但相關研究報道較少，結論不明。本研究擬探討ETV6/RUNX1融合基因陽性和陰性的B-ALL患兒各時間點MRD的差異和臨床意義，以期為不同融合基因背景B-ALL患兒的預后評估提供參考。

1 材料和方法

1.1 研究對象

選取2018年1月—2021年6月鄭州大學附屬兒童醫院收治的B-ALL患兒234例，其中ETV6/RUNX1融合基因陽性78例（陽性組），陰性156例（陰性組）。納入標準：1）年齡<18歲；2）經法美英分型標準和流式細胞術免疫分型確診為B淋巴細胞白血病的初診患兒；3）初診時接受46種融合基因檢測，確認為ETV6/RUNX1融合基因陽性或無融合基因背景（常見融合基因檢測均為陰性）；4）在鄭州大學附屬兒童醫院接受化療，并隨化療進程接受MRD監測；5）患兒隨訪資料完整。排除標準：1）混合系白血病患兒；2）未完成化療或化療開始3個月內死亡患兒。

1.2 方法

收集所有患兒入院時的一般資料，包括年齡、性別、初診白細胞計數、臨床危險度[7]，根據患兒的隨訪記錄統計其生存情況，無復發生存期（relapse-free survival，RFS）定義為從第1次完全緩解至疾病復發的時間。記錄患兒誘導化療第15天、第33天和鞏固治療開始前（第12周）的MRD檢測結果，分別記為MRD1、MRD2和MRD3。檢測方法：通過骨髓穿刺抽取患兒骨髓液2 mL，乙二胺四乙酸抗凝，2 h內送檢流式細胞術免疫分型檢測，檢測儀器為美國BD公司FACS canto型流式細胞儀。按照初診時的免疫分型結果制定個體化MRD檢測方案，檢測患兒有核細胞≥5×105個；采用CD45、CD19、CD38、CD20、CD10、CD34、CD58、CD123、CD13、CD33等抗體組合。首先根據CD45/CD19和CD19/SSC對CD19+細胞進行設門，然后對CD19+細胞進行其他抗體分析，以殘存細胞比例作為MRD值，MRD1和MRD2均以>1×10-3為陽性標準，MRD3以>1×10-4為陽性標準。典型MRD陽性結果見圖1。

圖1 典型MRD陽性流式細胞術檢測結果

1.3 統計學方法

采用SPSS 19.0軟件進行統計學分析。呈正態分布的計量資料以±s表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗；計數資料以例或率表示，組間比較采用χ2檢驗。采用Kaplan-Meier生存曲線分析ETV6/RUNX1融合基因與B-ALL患兒生存率之間的關系。采用多因素Cox回歸分析評價B-ALL患兒預后的影響因素。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 陽性組和陰性組一般資料比較

陽性組和陰性組年齡、性別、初診白細胞計數、臨床危險度、3次MRD陽性率差異均無統計學意義（P>0.05）。見表1。

表1 陽性組和陰性組一般資料比較

2.2 陽性組和陰性組患兒預后比較

234例患兒隨訪時間為4～46個月，中位隨訪時間為26個月，有18例（7.69%）患兒復發，5例（2.14%）患兒死亡。Kaplan-Meier生存曲線分析結果顯示，與陰性組比較，陽性組整體RFS較長（χ2=4.745，P=0.029），即復發率更低。見圖2。

圖2 ETV6/RUNX1融合基因與B-ALL患兒RFS的關系

2.3 MRD對ETV6/RUNX1融合基因陰性患兒預后的影響

在陰性組內，MRD1陽性患兒平均RFS為40個月，與陰性患兒（42個月）比較，差異無統計學意義（χ2=0.772，P>0.05）。MRD2和MRD3陽性患兒的平均RFS均為33個月，均短于MRD2和MRD3陰性患兒（均為43個月）（χ2值分別為9.747、11.697，P<0.05）。見圖3。

圖3 陰性組內各時間點MRD與患兒RFS的關系

以各時間點MRD、患兒年齡、性別、初診白細胞計數和臨床危險度（低危和中/高危）為自變量，采用Cox回歸分析B-ALL患兒預后的影響因素，方法為“條件（向前）”逐步回歸，結果顯示，年齡（≥10歲）、臨床危險度（中/高危）和MRD3陽性是陰性組患兒預后的獨立影響因素（P<0.05）。見表2。

表2 ETV6/RUNX1融合基因陰性患兒預后影響因素分析

2.4 MRD對ETV6/RUNX1融合基因陽性患兒預后的影響

在陽性組內，MRD1陽性患兒平均RFS為44個月，與陰性患兒（42個月）比較，差異無統計學意義（χ2=0.128，P>0.05）。MRD2和MRD3陽性患兒的平均RFS均為39、34個月，均短于MRD2和MRD3陰性患兒（均為45個月）（χ2值分別為1.567、4.266，P<0.05）。見圖4。

圖4 ETV6/RUNX1融合基因陽性組內各時間點MRD與患兒RFS的關系

進一步納入各時間點MRD和患兒一般資料進行多因素Cox回歸分析，結果顯示，年齡≥10歲和初診白細胞計數≥100×109/L是ETV6/RUNX1融合基因陽性患兒預后的獨立影響因素（P<0.05）。見表3。

表3 ETV6/RUNX1融合基因陽性患兒RFS影響因素分析

3 討論

隨著臨床診療技術的進步，B-ALL患兒的整體生存率已逐步提高，但仍有20%～30%患兒化療失敗[8]。除環境因素外，遺傳因素也是患兒發病的重要原因。近年來，兒童白血病融合基因相關研究成果在臨床診斷上的應用也逐漸普及。ETV6/RUNX1融合基因是一種常見的融合基因類型，由位于12號染色體上的ETV6基因與位于21號染色體上的RUNX1基因剪切重組后形成，可影響造血干細胞的復制、分化等生物學過程，參與白血病的發生和發展[9]。有研究發現，約25%的B-ALL患兒ETV6/RUNX1融合基因陽性，占有融合基因背景B-ALL患兒的40%[10]。關于ETV6/RUNX1融合基因與B-ALL患兒預后的關系，相關研究報道其5年無病生存率顯著高于其他亞型[11]，但不同研究對這一結論存在爭議，有學者認為其有促癌作用，有學者認為其可致病情進展，也有學者認為其與患者預后無相關性。MONTA?O等[12]發現，敲除淋巴細胞ETV6/RUNX1融合基因，可以抑制淋巴細胞惡性增殖、凋亡抗性和體內成瘤能力，提示該基因發揮促癌作用。AMPATZIDOU等[13]發現，ETV6/RUNX1融合基因陽性ALL患者中存在淋巴細胞克隆異質性和MRD清除功能受損，最終導致疾病的復發和不良預后。BHOJWANI等[14]發現，ALL患兒ETV6/RUNX1陽性表達與年齡<10歲、低風險分級和治療第19天的MRD水平相關，ETV6/RUNX1陽性患兒的無事件生存率明顯更高（P<0.05）。WANG等[15]發現，ETV6/RUNX1融合基因陽性ALL患兒風險分層治療完全緩解率高、遠期療效好。相關研究結果顯示，ETV6/RUNX1在白血病中的臨床意義與其作用機制有關，一方面，ETV6/RUNX1可以激活PI3K/Akt/mTOR等致癌通路，促進細胞增殖、細胞黏附和DNA損傷反應；另一方面，ETV6/RUNX1高表達也會提高治療反應性，利于疾病預后，爭議可能與研究對象和目的的差異有關[12，16]。本研究結果顯示，與陰性組比較，陽性組患兒的RFS顯著延長（P=0.029），提示ETV6/RUNX1融合基因陽性是患兒無復發生存的保護因素，與WANG等[15]的研究結論一致。

復發是威脅B-ALL患兒生存的最主要原因，及早診斷和調整治療方案是改善患兒預后的關鍵。隨著流式細胞術診療技術水平的逐步提高，MRD檢測也在白血病患兒化療療效監測中廣泛開展。盡管MRD是觀察療效最直觀的指標，但目前關于MRD監測的時間點和閾值設定仍未達成共識[17-18]。這是因為腫瘤細胞是在治療過程中被逐步消滅的，MRD陽性，尤其是化療早期陽性并不意味著患兒一定會復發；同時，因MRD閾值和檢測精度的原因，MRD陰性也不等同于癌細胞的絕對清除。目前的研究多以患兒誘導化療第15天、第28～33天和鞏固治療開始前（第12～13周）為監測點，即多數研究認為這幾個時間點的MRD與預后相關性較好[19]。目前，關于MRD與ETV6/RUNX1融合基因相關性的研究尚不多見，不同融合基因背景患兒MRD檢測的臨床意義是否存在差異尚無明確結論[20-21]。危彤等[6]發現，MRD監測僅對無融合基因背景的B-ALL患兒的預后有意義，而對于ETV6-RUNX1或E2A-PBX1陽性的患兒無顯著預測價值。本研究結果顯示，陰性組中，治療第15天MRD陰性和陽性患兒RFS差異無統計學意義（P>0.05），而治療第33天和第12周時MRD陽性患兒RFS顯著短于陰性患兒（P<0.05），MRD3陽性是此類患兒預后的獨立影響因素；而陽性組中，治療第15天和第33天MRD陰性、陽性患兒RFS差異無統計學意義（P>0.05），治療第12周時MRD陽性患兒RFS顯著短于陰性患兒（P<0.05），但多因素分析結果顯示，MRD3并非此類患兒預后的獨立影響因素。由此可以看出，不同融合基因背景下各時點MRD意義存在差異。分析其原因，可能在于白血病是一種遺傳因素占主導地位的惡性疾病，在存在融合基因的情況下，患兒病情的進展主要受遺傳特征、基因導向等因素影響，MRD的預后提示價值相對較弱；在無融合基因背景的情況下，患兒的治療反應性是決定預后的根本因素，而MRD是直接反映治療反應的指標，因此對預后的提示意義相對較大。臨床在制定患兒化療和療效監測方案時，可綜合考慮患兒的融合基因背景，以合理決策，使患兒受益。

綜上所述，ETV6/RUNX1融合基因陽性的B-ALL患兒整體預后優于該融合基因陰性的患兒，其中誘導化療第12周時的MRD水平是ETV6/RUNX1融合基因陰性患兒預后的獨立影響因素，但各時間點MRD對于ETV6/RUNX1融合基因陽性患兒預后無顯著影響，臨床可參考患兒融合基因背景制定個性化MRD監測方案，從而在保證預后的前提下，減少患兒穿刺操作，改善患兒診療體驗，降低醫療成本。