血清顆粒蛋白前體在Ⅰ型自身免疫性肝炎預后評估中的價值

任薈蓉 徐婷娟 武 濤 黃 玫 楊 亮

（1.中國科學技術大學附屬第一醫院檢驗科，安徽 合肥 230001；2.中國科學技術大學附屬第一醫院老年病研究所，安徽 合肥 230001；3.中國科學技術大學附屬第一醫院普外科實驗室，安徽 合肥230001；4.中國科學技術大學附屬第一醫院感染性疾病科，安徽 合肥 230001）

自身免疫性肝炎（autoimmune hepatitis，AIH）是一類以肝臟酶類升高、高免疫球蛋白血癥、自身抗體升高和肝臟炎癥浸潤為特征的慢性自身免疫性疾病[1]；依據自身抗體類型可分為Ⅰ型AIH和Ⅱ型AIH。Ⅰ型AIH是最常見的AIH類型，患者抗核抗體（antinuclear antibody，ANA）和/或抗平滑肌抗體（anti-smooth muscle antibody，ASMA）陽性，而Ⅱ型AIH患者抗肝腎微粒體1抗體陽性[2]。AIH起病隱匿，早期癥狀無臨床特異性，但誘發的肝損傷卻很嚴重，晚期需進行肝移植。據報道，約有5.9%的AIH患者在疾病晚期階段才得以明確診斷，早期診斷對于AIH患者的預后尤為重要[3]。然而，AIH的病因學尚不清楚，這造成了目前缺乏有效的AIH治療方案和早期診斷標志物。既往研究證實，AIH發病與遺傳、環境和免疫反應等因素密切相關，其中免疫平衡紊亂在AIH發病過程中扮演重要角色[4]。抗自身肝臟抗原的免疫反應若得不到適當調控會誘發嚴重的肝臟損傷。越來越多的研究發現，輔助性T細胞（T helper cell，Th）1/Th2失衡與AIH的發病機制密切相關，Th17/調節性T細胞（regulatory T cell，Treg）及其效應細胞因子白細胞介素（interleukin，IL）17/IL-10平衡紊亂參與了AIH的發生、發展[5]。顆粒蛋白前體（progranulin，PGRN）是新近發現的由免疫細胞廣泛表達的新型細胞因子，在炎癥反應中起調節作用。有研究發現，PGRN可促進CD4+T細胞向Treg分化，并增強Treg的功能[6]。動物實驗結果顯示，PGRN缺陷小鼠T細胞和B細胞介導的免疫功能紊亂[7]。系統性紅斑狼瘡、類風濕性關節炎和干燥綜合征等多種自身免疫性疾病患者PGRN水平異常[7]。但關于PGRN在AIH患者中的研究很少。為此，本研究擬探討Ⅰ型AIH PGRN水平的變化及其與肝臟損傷指標之間的關性。

1 材料和方法

1.1 研究對象

選取2016年5月—2021年4月中國科學技術大學附屬第一醫院確診為Ⅰ型AIH的患者39例（AIH組），其中男26例、女13例，年齡（49.71±13.21）歲；ANA和ASMA均陽性6例，ANA單陽性28例，ASMA單陽性5例。所有患者均處于疾病活動期[丙氨酸氨基轉移酶（alanine aminotransferase，ALT）或天門冬氨酸氨基轉移酶（aspartate aminotransferase，AST）>50 U/mL]；有25例患者在急性發作時單獨使用潑尼松龍治療，中位劑量為100 mg；其他14患者采用潑尼松龍和硫唑嘌呤聯合治療，中位劑量均為100 mg。AIH診斷參照1999年國際自身免疫性肝炎小組（the International Autoimmune Hepatitis Group，IAIHG）制定的AIH診斷和臨床評分標準[8]，排除其他自身免疫性疾病、結締組織病、慢性炎癥性疾病、酒精性肝病、藥物性肝病、病毒性肝炎和遺傳代謝性肝病，排除近6個月內接受過免疫抑制劑或糖皮質激素治療的患者。另選取同期中國科學技術大學附屬第一醫院健康體檢者35名（正常對照組），其中男24名、女11名，年齡（48.93±11.47）歲，均無慢性炎癥病史。2個組之間年齡和性別差異均無統計學意義（P>0.05）。本研究經中國科學技術大學附屬第一醫院倫理委員會批準（2020 KY倫審第124號），所有研究對象均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 樣本采集和處理

采集Ⅰ型AIH患者治療前、健康體檢者體檢當日清晨的空腹靜脈血10 mL，其中2 mL置于乙二胺四乙酸抗凝管中，用于白細胞（white blood cell，WBC）計數；另8 mL置于干燥管中，離心分離血清，-80 ℃保存備用，用于檢測血清肝臟酶類、自身抗體和PGRN、IL-10、IL-17水平。

1.2.2 各項指標的檢測

采用酶聯免疫吸附試驗檢測血清PGRN、IL-10和IL-17水平，試劑盒均購自美國R&D公司，檢測儀器為ST-360酶標儀（上海科華公司）。采用BC-6900全自動血液分析儀（深圳邁瑞公司）及配套試劑檢測WBC。采用ADVIA 2400全自動生化分析儀（德國西門子公司）及配套試劑檢測ALT、AST、γ-谷氨酰基轉移酶（gamma-glutamyltransferase，GGT）、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、總膽紅素（total bilirubin，TB）、直接膽紅素（direct bilirubin，DBil）、IgG、IgM和IgA水平。采用Sprinter XL全自動熒光免疫分析儀（德國歐蒙公司）及配套試劑檢測ANA和ASMA。嚴格按儀器和試劑盒說明書進行操作。

1.2.3 Ⅰ型AIH患者治療前后各項指標的變化

追蹤隨訪12例Ⅰ型AIH患者治療后8周各項指標的變化。將血清ALT升高至參考區間上限的2倍以上（ALT>90 U/L）定義為AIH復發。

1.3 統計學方法

采用SPSS19.0軟件進行統計分析。呈正態分布的計量資料以±s表示，2個組之間比較采用獨立樣本t檢驗。計數資料以例或率表示，組間比較采用χ2檢驗。采用Spearman相關分析評估各項指標之間的相關性。采用受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線評價血清PGRN判斷Ⅰ型AIH復發的效能。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 AIH組和正常對照組一般資料比較

AIH組WBC計數、ALT、AST、GGT、ALP、TB、DBil、IgG、IgM、IgA水平和ANA、ASMA陽性率均顯著高于正常對照組（P<0.05）。見表1。

表1 AIH組和正常對照組的一般資料比較

2.2 AIH組和正常對照組血清PGRN、IL-10、IL-17水平比較

AIH組血清PGRN、IL-17水平顯著高于正常對照組（P<0.05），血清IL-10水平顯著低于正常對照組（P<0.05）。見表2。

表2 AIH組和正常對照組血清PGRN、IL-10和IL-17水平比較

2.3 Ⅰ型AIH患者PGRN與其他指標的相關性

Ⅰ型AIH患者PGRN與IL-17、GGT、IgG和IgM均呈正相關性（r值分別為0.410、0.489、0.596、0.525，P<0.05）；與IL-10、WBC計數、ALT、AST、ALP、TB、DBil和IgA均無相關性（r值分別為-0.297、0.152、0.208、0.211、0.293、0.157、0.134、0.284，P>0.05）。

2.4 Ⅰ型AIH患者治療前后血清PGRN水平變化

隨訪的12例Ⅰ型AIH患者治療后血清PGRN、ALT、AST、GGT、ALP、IgG、IgM和IgA水平均顯著低于治療前（P<0.01），見表3、圖1。有1例患者治療后PGRN水平高于治療前，追蹤發現該例患者為復發患者。

圖1 Ⅰ型AIH患者治療前后血清PGRN水平的變化

表3 治療前后AIH患者常規指標檢測結果比較

2.5 Ⅰ型AIH患者血清PGRN水平與復發的關系

39例Ⅰ型AIH患者中有8例出現復發（復發組），其中3例在免疫抑制治療停止后復發、5例在免疫抑制治療期間復發；其余31例患者未復發（未復發組）。復發組治療前血清PGRN水平顯著高于未復發組（P<0.05），見圖2。

圖2 復發組和未復發組血清PGRN水平的比較

ROC曲線分析結果顯示，血清PGRN判斷Ⅰ型AIH復發的曲線下面積（area under curve，AUC）為0.78，最佳臨界值為80.75 pg/mL，敏感性為62.50%，特異性為83.33%。見圖3。

圖3 血清PGRN判斷Ⅰ型AIH復發的ROC曲線

3 討論

PGRN最初被鑒定為促進上皮細胞增殖和創傷愈合的生長因子，由7.5個半胱氨酸基序按P-G-F-B-A-C-D-E順序組成，主要表達于上皮細胞、免疫細胞、神經細胞和軟骨細胞中[9]。此外，PGRN也被發現在多種腫瘤中高表達，可能參與了早期胚胎發育、細胞增殖分化、抵抗宿主感染和炎癥反應等多種病理生理過程[10-11]。PGRN還可與腫瘤壞死因子受體結合，在機體免疫平衡調控中扮演重要角色[12]。WANG等[13]的研究結果顯示，椎間盤退行性變患者PGRN水平異常升高，通過調控炎癥作用軸IL-17/IL-10發揮保護作用，其主要的生物學效應為抑制促炎細胞因子IL-17的生成，促進抑炎細胞因子IL-10的分泌。LI等[14]發現，柯薩奇病毒B3感染患者PGRN水平升高，抑制了Th17的分化，使IL-17分泌減少。在結腸炎模型中，PGRN可誘導Treg分化和IL-10分泌，發揮保護作用[15]。由此可見，PGRN可能是通過調控IL-17/IL-10平衡來參與炎癥性疾病的發生、發展。

IL-17/IL-10失衡目前已被證實與AIH密切相關。LIANG等[5]的研究結果顯示，活動期AIH患者IL-17水平顯著升高，IL-10水平顯著降低，與本研究結果一致。但在AIH患者中，IL-17/IL-10失衡的調控機制是否與PGRN相關并不清楚。本研究結果顯示，活動期Ⅰ型AIH患者血清PGRN水平顯著高于正常對照者（P=0.000），這與在皮肌炎[16]、炎癥性腸病[17]、類風濕性關節炎[18]和骨關節炎[19]中的變化一致。在這幾類疾病中，PGRN均被證實通過抑制炎癥反應來發揮保護作用，其高表達可能是機體的代償效應，但這種代償效應并不足以控制機體炎癥。另外，有研究發現，在糖尿病患者中，雖然PGRN同樣上調，但體外試驗和動物模型均證實PGRN可通過上調炎癥因子IL-6、內質網應激和細胞自噬途徑誘導胰島素耐受，導致糖耐量受損[20]。TANAKA等[21]也發現，系統性紅斑狼瘡患者PGRN水平顯著升高，且與IL-6呈正相關（rs=0.47，P<0.000 1）；細胞實驗結果表明，PGRN可促進IL-6的分泌，參與了系統性紅斑狼瘡的致病機制。AIH患者中高表達的PGRN是發揮保護作用還是促進炎癥作用，有待于進一步在動物模型中通過過表達和基因敲除實驗加以證實。本研究還發現，PGRN與IL-17、GGT、IgG和IgM均呈正相關（r=0.410、0.489、0.596、0.525，P<0.05），與IL-10無相關性（r=-0.297，P>0.05），提示PGRN或可作為反映Ⅰ型AIH患者炎癥程度和肝臟損傷程度的指標之一。

本研究結果顯示，Ⅰ型AIH復發患者血清PGRN水平顯著高于未復發患者（P<0.05）；ROC曲線分析結果顯示，血清PGRN判斷Ⅰ型AIH患者復發的最佳臨界值為80.75 pg/mL，敏感性為62.50%，特異性為83.33%。與持續緩解的AIH患者相比，復發患者更易發展成肝硬化，出現食道靜脈曲張，并因肝功能衰竭致死[22-23]。本研究發現，有1例Ⅰ型AIH患者治療后血清PGRN水平高于治療前，追蹤發現該例患者為復發患者；另有2例AIH患者血清PGRN水平下降不明顯，推測可能與患者對免疫治療方案敏感性較低有關。由此可見，血清PGRN水平可能有助于判斷AIH的復發情況。

值得注意的是，目前用于檢測PGRN的酶聯免疫吸附試驗試劑盒并不能區分全長PGRN和顆粒蛋白片段。與全長PGRN不同的是，顆粒蛋白片段是發揮促炎效應的[24]。因此，在某些疾病中，PGRN可能被加工成為顆粒蛋白片段，導致不同疾病之間的研究結論出現差異。此外，PGRN在不同疾病中發揮的作用可能也有一定的差異。因此，后續我們將進一步擴大樣本量，從mRNA和蛋白水平檢測PGRN表達的變化，并通過動物模型探討PGRN在AIH中的可能作用機制。

綜上所述，Ⅰ型AIH患者血清PGRN水平升高，且與AIH的療效和復發有關，或可作為評價肝臟炎癥反應程度、損傷程度和疾病復發的指標。