血清miR-326與治療相關性血液系統惡性腫瘤患者化療敏感性和預后的關系

陳 哲 張 靈 劉 潔 王 霞 張 斌 高炳華

（1.河北北方學院附屬第一醫院血液科，河北 張家口 075000；2.河北北方學院附屬第一醫院檢驗科，河北 張家口 075000）

血液系統惡性腫瘤的治療以放療、化療和造血干細胞移植為主，但放療和/或化療遠期毒副作用可能導致治療相關性腫瘤的發生，其中治療相關性血液系統惡性腫瘤發病率較高[1]。血液系統惡性腫瘤是一組異質性疾病，是由造血干細胞或祖細胞發生突變，失去進一步分化成熟的能力而被阻滯在不同階段導致的[2]。目前，對于治療相關性血液系統惡性腫瘤尚無標準化的治療方案，臨床應遵循個體化原則，最大程度改善患者預后。因此，尋找新的指標對患者化療敏感性、預后預測和指導治療意義重大。微小RNA是長度約為22個核苷酸的小分子RNA，參與腫瘤的多種惡性生物學行為，如細胞增殖、侵襲、轉移、凋亡，其水平與腫瘤的發生、發展密切相關[3]。微小RNA-326（microRNA-326，miR-326）作為一種抑癌基因，在多種惡性腫瘤中發揮作用[4]。有研究發現，該基因低表達與食道鱗狀細胞癌、非小細胞肺癌轉移風險呈正相關[5]，但在治療相關性血液系統惡性腫瘤中的研究鮮有報道。本研究擬分析治療相關性血液系統惡性腫瘤患者血清miR-326表達水平，并探討其與化療敏感性和預后的關系。

1 材料和方法

1.1 研究對象

選取2012年1月—2021年1月河北北方學院附屬第一醫院血液科50例治療相關性血液系統惡性腫瘤患者（研究組），其中男29例、女21例，年齡（49.68±10.54）歲，體重指數（body mass index，BMI）為（22.54±2.17）kg/m2。納入標準：1）符合《血液病診斷及療效標準》[6]中治療相關性血液系統惡性腫瘤的診斷標準；2）經細胞形態學、免疫學、細胞遺傳學、分子生物學和病理學檢查確診為治療相關性血液系統惡性腫瘤；3）影像學檢查證實腫瘤無髓外轉移；4）由原發腫瘤放療、化療后繼發為治療相關性血液系統惡性腫瘤；5）入院后接受化療；6）完成隨訪；7）年齡≥18歲。排除標準：1）近期發生急、慢性嚴重感染；2）入院前6個月內發生過大面積心肌梗死、心源性休克、急性心力衰竭等嚴重疾病；3）中途退出治療或隨訪期間失訪、死亡；4）患嚴重肝、腎疾病或精神疾??；5）同時參與其他臨床試驗；6）發生非腫瘤病癥阻礙繼續治療。以同期河北北方學院附屬第一醫院40例無原發實體瘤的血液系統惡性腫瘤患者作為對照組，其中男22例、女18例，年齡（50.12±11.08）歲，BMI為（22.15±2.35）kg/m2；包括骨髓增生異常綜合征10例、急性髓系白血?。ǚ荕3）8例、急性早幼粒細胞白血病12例、急性淋巴細胞白血病10例。2個組之間性別、年齡、BMI差異均無統計學意義（P>0.05）。本研究經河北北方學院附屬第一醫院醫學倫理委員會批準，所有研究對象及其家屬均知情同意，并簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 血清miR-326相對表達量檢測

采集研究組化療前、后和對照組清晨空腹靜脈血5 mL，1 308×g離心10 min，收集血清。提取血清總RNA，采用TaqMan microRNA逆轉錄試劑盒（北京百奧萊博科技有限公司）將RNA逆轉錄成互補DNA（complementary DNA，cDNA），根據SteataPrep RCR純化試劑盒[安捷倫科技（中國）有限公司]說明書要求配制聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）體系，檢測儀器為MA-6000實時熒光定量PCR儀（蘇州雅睿生物技術股份有限公司）。反應條件：95 ℃預變性20 s；95 ℃ 10 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 10 s，40個循環；72℃ 10 min。以U6為內參基因，采用2-ΔΔCt法計算miR-326的相對表達量。miR-326和U6引物均由生工生物工程（上海）有限公司合成，miR-326正向引物為5'-GCGCGTGGTTCTAGACTTGC-3'，反向引物為5'-ATCCAGTGCAGGGTCCGAGG-3'；U6正向引物為5'-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3'，反向引物為5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。

1.2.2 隨訪和分組

根據文獻[6]的標準將研究組再分為化療有效組（35例）和化療無效組（15例）。對研究組隨訪至2022年1月，記錄終點事件（隨訪終點為全因死亡），根據終點事件發生與否將研究組分為存活組（28例）和死亡組（22例）。

1.2.3 臨床資料收集

收集存活組和死亡組的臨床資料，包括性別、年齡、BMI、基礎疾?。ǜ哐獕骸⑻悄虿?、高血脂等）、感染、凝血功能、原發腫瘤類型和治療方案、再發腫瘤類型和治療方案、再發腫瘤化療周期、臟器功能損傷程度、住院天數。

1.3 統計學方法

采用SPSS 26.0軟件進行統計分析。呈正態分布的計量資料以±s表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗。計數資料采用例或率表示，組間比較采用χ2檢驗。采用Spearman相關分析評估血清miR-326相對表達量與治療相關性血液系統惡性腫瘤患者化療敏感性的相關性。采用Logistic回歸分析評價患者臨床特征與治療相關性血液系統惡性腫瘤患者預后的關系。采用受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線評價血清miR-326相對表達量預測治療相關性血液系統惡性腫瘤患者預后的效能。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 研究組和對照組血清miR-326相對表達量比較

研究組血清miR-326相對表達量（0.38±0.05）顯著低于對照組（1.46±0.15）（P<0.001）。

2.2 化療有效組和化療無效組化療前、后血清miR-326相對表達量比較

2個組化療前血清miR-326相對表達量差異無統計學意義（P>0.05）；化療有效組化療后血清miR-326相對表達量較化療前升高（P<0.05）；化療無效組化療前、后血清miR-326相對表達量差異無統計學意義（P>0.05）。見表1。

表1 化療有效組和化療無效組化療前、后血清miR-326相對表達量比較

2.3 血清miR-326相對表達量與治療相關性血液系統惡性腫瘤患者化療敏感性的相關性

Spearman相關分析結果顯示，血清miR-326相對表達量與治療相關性血液系統惡性腫瘤患者化療敏感性呈正相關（r=0.641，P<0.05）。

2.4 存活組和死亡組臨床資料比較

死亡組高血壓、感染、凝血功能異常、再發腫瘤化療周期（≥5個）、臟器功能損傷所占比例均高于存活組（P<0.05），血清miR-326相對表達量低于存活組（P<0.05）；2個組性別、年齡、BMI、糖尿病、高血脂、原發腫瘤類型和治療方案、再發腫瘤類型和治療方案、住院天數比較，差異均無統計學意義（P>0.05）。見表2。

表2 存活組和死亡組臨床資料比較

2.5 治療相關性血液系統惡性腫瘤患者預后危險因素分析

將治療相關性血液系統惡性腫瘤患者預后情況作為因變量（Y），將存活組和死亡組臨床資料比較差異有統計學意義的因素[高血壓、感染、凝血功能異常、再發腫瘤化療周期（≥5個）、臟器功能損傷、血清miR-326相對表達量]作為自變量（X）進行Logistic回歸分析（賦值結果見表3），結果顯示，感染、凝血功能異常、臟器功能損傷、低血清miR-326相對表達量均是治療相關性血液系統惡性腫瘤患者預后不良的危險因素（P<0.05）。見表4。

表3 Logistic回歸分析賦值

表4 治療相關性血液系統惡性腫瘤患者預后多因素Logistic回歸分析

2.6 血清miR-326相對表達量對治療相關性血液系統惡性腫瘤患者預后的預測價值

ROC曲線分析結果顯示，血清miR-326相對表達量判斷治療相關性血液系統惡性腫瘤患者預后的ROC曲線下面積為0.868（95%可信區間為0.777～0.959），最佳臨界值為0.44，敏感性和特異性分別為86.80%和78.10%，約登指數為0.649，P<0.001。見圖1。

圖1 血清miR-326相對表達量預測治療相關性血液系統惡性腫瘤患者預后的ROC曲線

3 討論

目前，惡性腫瘤患者治療相關性血液系統惡性腫瘤的發生機制尚不明確，多數研究結果表明放療或化療或為主要危險因素[7]。放療可引起造血干細胞DNA堿基脫落、轉換、顛覆，產生移碼突變或點突變，以及染色體畸變，某些化療藥物，如細胞毒藥物烷化劑（鉑類、環磷酰胺），可與DNA交聯導致基因突變，繼而導致細胞增殖失控、分化受阻，而拓撲異構酶抑制劑可與DNA、拓撲異構酶Ⅱ形成三聯體，阻斷拓撲異構酶連接活性，使DNA鏈斷裂，從而增加治療相關性血液系統惡性腫瘤的發生風險[8-9]。另外，宿主和環境因素等也可能與治療相關性血液系統惡性腫瘤的發生關系密切，不同個體基因多態性在編碼藥物代謝相關酶系、DNA修復、藥物轉運和靶點方面的差異決定了患者的腫瘤易感性[10]。

目前尚缺乏治療相關性血液系統惡性腫瘤的特異性生物標志物，難以評估不同治療方案對患者預后的影響，亟需尋找新指標。有研究結果表明，miR-326在胃癌組織中的相對表達量明顯低于癌旁組織，且與腫瘤大小、淋巴轉移、分化程度和臨床分期均有關[11]；miR-326在腦膠質瘤組織中的表達顯著低于正常腦組織，與晚期病理分級和KPS評分等有關[12]。提示miR-326在多種類型惡性腫瘤中異常表達，并通過多種途徑參與細胞增殖和凋亡過程，影響疾病進程。然而，miR-326在治療相關性血液系統惡性腫瘤中是否異常表達鮮有報道。本研究中，研究組血清miR-326相對表達量低于對照組（P<0.001）。說明血液系統惡性腫瘤患者血清miR-326表達異常，提示miR-326可能作為抑癌基因存在于患者血液中，其表達下降可能會激活相關癌基因，從而參與治療相關性血液系統惡性腫瘤的發生、發展，在臨床治療過程中應重點監測[13-14]。有學者指出，部分微小RNA在惡性腫瘤患者化療過程中對腫瘤細胞化療敏感反應有一定調控作用。本研究結果顯示，化療有效組化療后血清miR-326相對表達量較化療前有所升高，而化療無效組化療前、后血清miR-326相對表達量差異無統計學意義（P>0.05）；相關分析發現，血清miR-326相對表達量與治療相關性血液系統惡性腫瘤患者化療敏感性呈正相關（r=0.641，P<0.05），表明miR-326表達下調與治療相關性血液系統惡性腫瘤患者化療抵抗有關。

已有大量研究將血清微小RNA作為腫瘤生物標志物用于疾病診斷和預后評估，使通過血清miRNA判斷治療相關性血液系統惡性腫瘤患者預后成為可能。本研究中，死亡組血清miR-326相對表達量低于存活組（P<0.001）；Logistic回歸分析結果顯示，低水平血清miR-326是治療相關性血液系統惡性腫瘤患者預后不良的危險因素之一。以上結果均提示miR-326低表達與治療相關性血液系統惡性腫瘤患者較差的預后有關。GHODOUSI等[15]發現，miR-326低表達是急性淋巴細胞白血病患兒生存和預后不良的生物標志物；生物信息學分析數據顯示，miR-326可能對急性淋巴細胞白血病微小RNA具有調節作用，可能誘發急性淋巴細胞白血病患兒對治療藥物耐藥。本研究ROC曲線分析結果顯示，血清miR-326相對表達量判斷治療相關性血液系統惡性腫瘤患者預后的曲線下面積為0.868，當血清miR-326相對表達量<0.44時，提示治療相關性血液系統惡性腫瘤患者有預后不良風險，說明血清miR-326對治療相關性血液系統惡性腫瘤患者預后預測價值良好。ABERUYI等[16]也發現，miR-326表達在急性淋巴細胞白血病患兒的預后中具有良好預測價值，與本研究結果一致。因此，臨床在積極控制治療相關性血液系統惡性腫瘤患者感染、凝血功能異常、化療周期、臟器功能損傷等常見危險因素的同時，也應密切關注并監測血清miR-326相對表達量變化，以便及時采取應對措施，改善患者預后。

綜上所述，血清miR-326相對表達量與治療相關性血液系統惡性腫瘤患者化療敏感性和預后關系密切，對患者預后有較高的預測價值。但本研究樣本量和隨訪時間有限，有待通過更深入的研究來彌補不足。