化學發光法干擾素-γ釋放試驗在肺結核輔助診斷中的價值

蓋林林 李海波 褚錦錦 孫家梅 閆心怡 杜金珂 代文清 徐棟花

（濰坊市人民醫院中心實驗室，山東 濰坊 261000）

結核病是一種由結核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）引起的復雜性、慢性傳染病，嚴重威脅人類的生命健康。據世界衛生組織（World Health Organization，WHO）全球結核病報告估算，全球約有1/3人口感染MTB；2019年，我國約有83.3萬新發結核病病例[1-2]。結核病的發病機制復雜，患者臨床表現、影像學特征多樣，目前的實驗室檢驗主要包括分子生物學、細菌學和免疫學方法，在敏感性和特異性上均不能滿足臨床需求，因此迫切需要一種快速診斷結核病的方法[3]。結核病是MTB在細胞內形成的一種遲發型過敏反應（Ⅳ型），檢測MTB產生的特異性T淋巴細胞或可成為判斷感染的新思路[4]。本研究采用化學發光干擾素-γ釋放試驗對濰坊地區183例肺結核確診患者和33名健康體檢者進行檢測，進一步探討該方法在肺結核快速診斷中的臨床應用價值。

1 材料和方法

1.1 研究對象

選取2019年3月1日—2020年12月31日濰坊市人民醫院住院的肺結核患者183例，根據活動性肺結核和非活動性肺結核的診斷標準[5]分為活動性肺結核組（109例）和非活動性肺結核組（74例）。另選取同期維坊市人民醫院健康體檢者33名（對照組），均無結核病病史、家族感染史，近6個月無活動性結核病患者密切接觸史等。所有研究對象均無人類免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）感染和嚴重的肝、腎功能損傷。本研究經濰坊市人民醫院醫學倫理委員會批準，所有研究對象均知情同意。

1.2 方法

1.2.1 化學法光法干擾素-γ釋放試驗檢測

采集所有研究對象外周血5 mL（盡量空腹）于肝素鈉抗凝真空管內，充分顛倒混勻，16 h內送檢。將全血混勻后分別添加到本底對照管（N）、測試培養管（T）、陽性對照培養管（P）中，每個培養管加入肝素鈉抗凝全血1 mL。將上述培養管顛倒混勻5～10次后，迅速放入37 °C培養箱中培養（22±2）h，將培養后的肝素鈉抗凝全血以1 609×g離心10 min，采用化學發光法進行檢測，試劑盒購自廈門萬泰凱瑞生物技術有限公司，檢測儀器為Caris200全自動化學免疫分析儀（廈門優邁科醫學儀器有限公司），根據試劑盒說明書要求判定結果。

1.2.2 血常規檢測

采集所有研究對象外周血2 mL，乙二胺四乙酸抗凝，采用XN-2000全自動血液分析儀（日本希森美康公司）及配套試劑檢測血常規。

1.2.3 結核菌素皮內試驗

所有研究對象均進行結核菌素皮內試驗。接種結核菌素純蛋白衍生物（北京祥瑞生物制品有限公司）48～72 h后，觀察硬結大小，以硬結>5 mm為陽性。

1.2.4 T-SPOT TB試驗

采集所有研究對象外周靜脈血5 mL，肝素抗凝，4 h內分離單個核細胞，洗滌2次，計數并稀釋至2.5×105/mL；向包被特異性抗體的4個微孔中分別加入陰性對照（AIMV）、10 kD培養濾液蛋白（culture filtrate protein 10，CFP10）、6 kD早期分泌性抗原靶蛋白（early secretary antigenic target-6 kD，ESAT6）和陽性對照（植物血凝素）各50 μL，然后每孔加入稀釋的單個核細胞懸液100 μL，置于37 ℃ 5%CO2培養箱溫孵育16～20 h；洗板4次，再加入特異性抗體，4 ℃孵育1 h；洗板4次，加入顯色液，37 ℃孵育7 min，加入蒸餾水終止反應；37 ℃烤箱10～20 min烤干，顯微鏡下計數斑點數。陽性結果判斷標準：1）陰性孔斑點數為0～5個時，A或B孔斑點數≥6個，判定為陽性；2）陰性孔斑點數≥6個時，A或B斑點數≥2×陰性孔斑點數，判定為陽性。

1.3 統計學方法

采用SPSS 17.0和GraphPad Prism 8.0軟件進行數據分析，正態分布計量資料以±s表示，比較采用t檢驗；計數資料以率或例表示，比較采用χ2檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 3個組一般資料比較

活動性肺結核組、非活動性肺結核組、對照組年齡、性別差異均無統計學意義（P>0.05）。見表1。

表1 3個組一般資料比較

2.2 3個組化學發光法干擾素-γ釋放試驗結果

活動性肺結核組化學發光法干擾素-γ釋放試驗陽性率最高（92.66%），3個組陽性率差異有統計學意義（P<0.05）。見表2。

表2 3個組化學發光法干擾素-γ釋放試驗檢測結果比較

2.3 不同方法診斷肺結核的效能

化學發光法干擾素-γ釋放試驗和T-SPOT TB試驗診斷肺結核的敏感性、特異性、陽性預測值和陰性預測值均高于結核菌素皮內試驗，但僅敏感性差異有統計學意義（P<0.05），特異性、陽性預測值和陰性預測值差異均無統計學意義（P>0.05）。化學發光干擾素-γ釋放試驗敏感性、特異性、陽性預測值和陰性預測值均稍高于T-SPOT TB試驗，但差異無統計學意義（P>0.05）。見表3。

表3 不同方法診斷肺結核的效能 %（例/例）

2.4 活動性肺結核組干擾素-γ釋放試驗陽性和陰性患者外周血白細胞計數、淋巴細胞絕對值、淋巴細胞百分比檢測結果比較

活動性肺結核組化學發光法干擾素-γ釋放試驗陽性和陰性患者外周血白細胞計數、淋巴細胞絕對值、淋巴細胞百分比差異均無統計學意義（P>0.05）。

3 討論

2019年，全球約有1 000萬結核病新增病例，且平均每年約有140萬例患者死于結核病[6-7]。我國居結核病高負擔國家的第3位，但近年來發病率呈逐漸下降的趨勢[7-9]。早期診斷和及時治療是控制MTB傳播的主要措施。干擾素-γ釋放試驗是近20來年發展起來的檢測特異性T淋巴細胞的技術，主要以MTB特有的RD1基因編碼的ESAT6和CFP10作為刺激原來檢測效應T淋巴細胞分泌干擾素-γ，因卡介苗和大多數非結核分枝桿菌無RD1基因，因此，該方法可有效區分卡介苗或大多數非結核分枝桿菌感染導致的假陽性結果。2006年，瑞士的抗腫瘤壞死因子α治療前結核病篩查指南[10]肯定了干擾素-γ釋放試驗的作用，推薦對潛伏性結核感染（latent tuberculosis infection，LTBI）患者可進行預防性治療。2013年，美國開始采用干擾素-γ釋放試驗篩查LTBI[11]。目前，已經有16個國家將干擾素-γ釋放試驗列入結核病臨床應用指南，用于結核病的輔助診斷，WHO也建議使用結核菌素皮內試驗和干擾素-γ釋放試驗用于結核病的篩查[12]。

目前，化學發光法干擾素-γ釋放試驗因操作簡單，可在采血后24 h內獲得結果，誤差小，易于標準化操作等優勢，成為臨床診斷MTB感染的主要方法。

本研究結果顯示，3種方法中，化學發光法干擾素-γ釋放試驗的敏感性最高（92.66%），特異性為90.91% ，陽性預測值為97.12%，陰性預測值為78.95%。與王新寧等[13]和AI等[14]研究結果一致。本研究中，活動性肺結核組有8例患者化學發光法干擾素-γ釋放試驗檢測為陰性，分別為4例肺惡性腫瘤化療患者和1例咳嗽患者、1例乳腺癌腦轉移患者、1例骨質疏松伴病理性骨折患者、1例肺炎性假瘤伴細支氣管炎患者，假陰性原因可能與樣本采集時間、機體發生細胞免疫反應的時間、機體自身免疫力、淋巴細胞的數量和質量等因素有關[15]。陳誠等[16]發現，干擾素-γ釋放試驗假陽性結果與陳舊性結核、肺癌等密切相關。本研究對照組中有3例假陽性，分別為1例肺惡性腫瘤術后、1例不明原因、1例既往感染者。提示對于化學發光法干擾素-γ釋放試驗假陰性和假陽性結果，臨床應根據各種輔助檢查和臨床癥狀綜合分析，以作出準確診斷。

本研究結果顯示，化學發光法干擾素-γ釋放試驗陰性與陽性活動性肺結核患者之間外周血白細胞計數、淋巴細胞計數差異均無統計學意義（P>0.05），與馬進寶等[17]和LV等[18]的研究結果不一致，可能與患者個體差異和淋巴細胞具體的免疫功能不同有關。

本研究尚存在一定的局限性：1）樣本量相對較小，結果可能存在偏差；2）未對免疫功能受損患者進行分析。

綜上所述，對于化學發光法干擾素-γ釋放試驗陽性的患者，應考慮結核病的可能。