膀胱癌組織miR-20a-5p、NR4A3表達及其與患者臨床病理特征、預后的關系

楊海北,王衛生,桂俊卿,徐躍文,崔茂榮,張超,劉志明

膀胱癌(bladder cancer,BC)發病率和病死率較高,是全球最常見的泌尿生殖系統惡性腫瘤之一,分為非肌層浸潤性(NMIBC,75%,T1)和肌肉浸潤性膀胱癌(MIBC,25%,T2～T4)[1-2]。BC易轉移、易復發、早期無明顯癥狀的特點使其在臨床中診斷困難,導致BC患者的診斷、治療被延誤,生存率和預后較差[3-5]。因此,尋求與BC相關的生物標志物對其早期診斷和預后十分重要。MicroRNA(miRs)的異常表達與腫瘤的增殖、分化、侵襲、遷移等生物學進展有關,據報道,miR-20a-5p在腫瘤發生中起復雜作用[6-7]。此外,核受體亞家族4成員3(NR4A3)的下調也被發現與髓系白血病中分化狀態受損有關[8]。miR-20a-5p、NR4A3在BC中表達及與預后的關系未見報道。因此,本試驗對其進行研究,報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2016年12月—2019年1月曲靖市第一人民醫院泌尿外科行手術治療BC患者30例,收集其膀胱癌組織及相應的癌旁組織,其中男11例,女19例,年齡35～68(52.44±7.94)歲,組織病理學分級按WHO標準:Ⅰ～Ⅱ級10例,Ⅲ級20例;臨床分期基于UICC-TNM標準[9]:Ⅰ～Ⅱ期13例,Ⅲ～Ⅳ期17例。本研究已經獲得醫院倫理委員會批準(2016-1109003),患者及家屬知情同意并簽署知情同意書。

1.2 病例選擇標準 (1)納入標準:①術后病理診斷為BC[10];②患者無化療及其他治療史;③患者的臨床病理資料完整。(2)排除標準:①患其他免疫系統或其他惡性腫瘤者;②有肝腎功能障礙及尿石癥、腺性膀胱炎反復發作者;③有嚴重心臟疾病及認知功能損傷者;④患有感染性疾病者。BC的病理類型由2位經驗豐富的病理學醫生獨立診斷。

1.3 觀測指標與方法

1.3.1 實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測miR-20a-5p、NR4A3表達:使用NanoDrop 1000(Thermo Scientific,USA)從處于凍存狀態病變組織(手術時收集)中提取總RNA,并進行逆轉錄。計算A260/A280比率以評估RNA質量和純度。在推薦的熱循環設置下,使用ABI 7300(ABI,Foster City,CA,USA)進行qRT-PCR分析,步驟如下:95℃初始循環30 s,然后95℃ 30 s 、58℃ 30 s 、72℃ 30 s ,共40個循環。分別以U6、β-actin為內參。基因相關序列見表1。反應結束后miR-20a-5p、NR4A3 mRNA的相對表達量采用2-ΔΔCt法計算。

表1 基因引物序列

1.3.2 隨訪情況:隨訪起點為手術開始時,終點為2022年1月,進行為期3年的術后隨訪。術后通過電話訪問、門診復查等方式對所有患者進行隨訪,全部病例無失訪,記錄患者生存情況。

2 結 果

2.1 miR-20a-5p、NR4A3在BC癌組織和癌旁組織中表達比較 與癌旁組織比較,BC癌組織的miR-20a-5p水平上升,NR4A3水平下降(P<0.01),見表2。

表2 miR-20a-5p、NR4A3在BC癌組織和癌旁組織表達比較

2.2 BC癌組織中miR-20a-5p與NR4A3 mRNA表達的相關性 Pearson相關性分析顯示,BC癌組織中miR-20a-5p與NR4A3表達呈負相關(r=-0.599,P<0.001)

2.3 miR-20a-5p、NR4A3表達在BC患者不同臨床病理參數中比較 病理Ⅲ級、TNM Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴結轉移BC患者miR-20a-5p表達高于病理Ⅰ～Ⅱ級、TNM Ⅰ～Ⅱ期、無淋巴結轉移者(P<0.05);病理Ⅲ級、TNM Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴結轉移者NR4A3表達低于病理Ⅰ～Ⅱ級、TNM Ⅰ～Ⅱ期、無淋巴結轉移者高于,差異均有統計學意義(P<0.01);BC患者miR-20a-5p、NR4A3表達在性別、年齡、吸煙史、肌層浸潤、腫瘤大小、腫瘤數量等方面比較,差異均無統計學意義(P>0.05),見表3。

2.4 miR-20a-5p、NR4A3表達與BC患者預后的關系 經過3年隨訪,30例BC患者死亡11例,生存19例,總生存率為63.33%。miR-20a-5p高表達者3年生存率為47.06%(8/17),低于低表達者的84.62%(11/13),差異有統計學意義(χ2=4.474,P=0.034);NR4A3低表達者3年生存率為37.50%(6/16),低于高表達者的92.86%(13/14),差異有統計學意義(χ2=9.853,P=0.002),見圖1。

2.5 BC患者預后影響因素的Cox回歸分析 以BC患者預后為因變量,以病理分級(Ⅰ～Ⅱ級=0,Ⅲ級=1)、TNM分期(Ⅰ～Ⅱ期=0,Ⅲ～Ⅳ期=1)、淋巴結轉移(無=0,有=1)、miR-20a-5p(具體值)、NR4A3(具體值)為自變量,進行多因素Cox回歸分析,結果顯示,miR-20a-5p高表達是影響膀胱癌患者預后的獨立危險因素(P<0.01),見表4。

3 討 論

BC是泌尿生殖系統常見惡性腫瘤之一,它在我國的發病率和病死率非常高,其患病率在發達國家甚至全世界都在上升[11-12]。2020年美國估計有81 400例新發病例和17 980例BC患者死亡,BC通過膀胱壁浸潤深度的測量可分為NMIBC和MIBC[13]。目前BC的診斷和監測的標準方法為膀胱鏡檢查,但膀胱鏡檢查的敏感度較低,不但易引起排尿困難和尿路感染等并發癥,還會造成漏診的情況[14]。此外,BC的異質性和易復發的特點也給BC的臨床診斷增加了困難,導致預后較差[10]。因此,尋找與BC關系密切的生物標志物對其早診斷、早治療,以期提高BC患者生存率和改善預后情況。

表3 miR-20a-5p、NR4A3表達在BC患者不同臨床病理參數中比較

圖1 BC癌組織miR-20a-5p、NR4A3表達與患者3年總生存率的關系

表4 影響BC患者預后的多因素Cox回歸分析

miRNA是小的、非編碼的單鏈RNA分子,長度約為22個核苷酸,它們與靶基因的3′-非翻譯區(3′ UTR)互補結合,導致mRNA降解或抑制翻譯,而miRNA失調與腫瘤生長、耐藥性和轉移有關,使其成為不同癌癥的潛在診斷和預后生物標志物[15]。miR-17-92簇位于13號染色體上MIR17HG(C13orf25)的內含子中,包括6個成員:miR-17、miR-18a、miR-19a、miR-19b、miR-20a和miR-92a,參與調節細胞增殖、細胞周期進程和細胞凋亡[15]。既往研究發現,miR-20a-5p是一種致癌基因,在前列腺癌、甲狀腺癌中,其高表達促進了腫瘤細胞的增殖和遷移[16-17]。本試驗結果進一步驗證了上述結論,即miR-20a-5p高表達對腫瘤細胞的侵襲和遷移有促進作用,從而進一步促進BC的發展。這也與既往實驗中外源性miR-20a-5p過表達促進BC細胞的增殖、遷移和侵襲的結果一致[10]。此外,miR-20a-5p高表達患者生存率顯著低于低表達患者,進一步通過Cox回歸分析發現,miR-20a-5p高表達是BC預后的獨立危險因素,在Stoen等[16]在前列腺癌的實驗中也發現類似結果。提示miR-20a-5p未來可能作為BC預后生物標志物。

NR4A3也稱為神經元衍生的孤兒受體1(NOR1),是孤兒核受體家族的成員,NR4A3是一種新的腫瘤抑制基因,其表達在腫瘤中下調,NR4A3的上調表達可以抑制癌細胞侵襲和轉移[18]。Son等[19]發現在激素療法聯合放療后,A549肺癌細胞中NR4A3水平升高,NR4A3可通過提高細胞內活性氧水平誘導細胞凋亡并抑制細胞增殖。Lin等[20]研究也表明,NR4A3維持MT-2信號傳導以抑制前列腺癌細胞侵襲、腫瘤生長和轉移,并通過促進p21和PAI-1表達作為TGF-β/Smad2信號通路抑制腫瘤。這與本試驗中NR4A3在BC腫瘤組織中的降低趨勢及抑制腫瘤細胞侵襲和遷移的結果一致。此外,Fan等[21]也發現,NR4A3在BC中表達下調,對BC細胞增殖和干性有抑制作用,進一步驗證了本研究結果。本試驗進一步研究發現,miR-20a-5p是NR4A3的靶基因,二者呈負調控關系。這與Zhao等[22]認為miR-20a可通過靶向NR4A3促進DRG神經元的軸突再生,以及Yang等[10]在BC實驗中表明,miR-20a-5p可以靶向NR4A3,即miR-20a-5p通過抑制抑瘤基因NR4A3的表達促進BC細胞的生長和轉移結果一致。以上結果顯示,miR-20a-5p通過負靶向NR4A3來參與BC疾病的發生、發展。但miR-20a-5p、NR4A3表達水平在BC中的發病機制尚不明確,本研究僅分析了BC患者癌組織中miR-20a-5p、NR4A3表達水平與其臨床病理特征和預后的關系,其具體機制還需進一步研究。

綜上所述,BC癌組織中miR-20a-5p表達水平升高,NR4A3表達水平降低,與BC病理分級、TNM分期、淋巴結轉移及預后有關,其中miR-20a-5p為BC預后的獨立危險因素,且miR-20a-5p通過負靶向調控NR4A3參與BC疾病的發生、發展。然而本研究僅將BC組織作為研究樣本,未能選取血清等其他樣本檢測驗證,且樣本量較小,試驗結果存在局限性,后期可進一步使用大樣本血清對其具體機制進行研究,對臨床中BC的診療提供基礎依據。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明

楊海北、王衛生:設計研究方案,實施研究過程,論文撰寫;桂俊卿、徐躍文:進行統計學分析;崔茂榮、張超:實施研究過程,資料搜集整理,論文修改;劉志明:提出研究思路,分析試驗數據,論文審核