生物鐘PRR蛋白促進擬南芥幼苗中花青素的合成

楊甲甲 楊米連 胡彥如

摘 要：生物鐘（circadian clock）是激發植物生理特征節律性表達，并使之維持穩定的保守內源調節機制。PRR（PSEUDO－RESPONSE REGULATOR）蛋白家族是生物鐘中央振蕩器的重要組成部分，調控植物的種子萌發、下胚軸伸長和開花等多種生命過程?；ㄇ嗨兀╝nthocyanin）是植物次生代謝產物，對植物的繁衍、生長發育和抵抗逆境脅迫具有重要作用。該研究以擬南芥（Arabidopsis thaliana）為對象，探討生物鐘PRR蛋白對花青素生物合成的調控功能和分子機制。結果表明：（1）在PRR基因單突變體及多突變體幼苗中，花青素的積累明顯降低，某些花青素合成相關基因的表達也顯著降低。（2）相反，在PRR5過表達幼苗中，花青素的積累以及某些花青素合成相關基因的表達則顯著升高。（3）蛋白相互作用結果顯示，PRR5蛋白能與MYB75、TT8、MYB90及MYB113等花青素調控蛋白相互作用，并形成復合物。（4）遺傳學分析結果顯示，擬南芥PRR5誘導幼苗中花青素的合成依賴于MYB家族花青素調控蛋白。綜上認為，生物鐘PRR蛋白可能通過PRR5與MYB75、TT8等相互作用，促進擬南芥幼苗中花青素的合成和積累。該研究結果對發掘PRR蛋白新的生物學功能，以及深入理解生物鐘信號調控植物幼苗的環境適應性具有重要意義。

關鍵詞： 擬南芥， 生物鐘， PRR蛋白， 花青素， MBW復合體

中圖分類號：Q943

文獻標識碼：A

文章編號：1000－3142（2023）04－0676－12

Abstract：The circadian clock is a conservative endogenous regulatory mechanism that stimulates and maintains the rhythmic expression of plant physiological characteristics. The PRR （PSEUDO－RESPONSE REGULATOR） protein family is acritical component of the circadian clock central oscillator and regulates a variety of life processes such as seed germination， hypocotyl elongation， and flowering. Anthocyanin is plant secondary metabolites， which plays an important role in plant reproduction， growth， development and stress responses. In this study， we took Arabidopsis thaliana as the research object and explored the function and mechanism of circadian clock PRR proteins in the control of anthocyanin biosynthesis. The results were as follows： （1） The accumulation of anthocyanin and the expression of some anthocyanin synthesis－related genes were significantly reduced in PRR genes single mutant and multiple mutant seedlings. （2） On the contrary， in the seedlings with overexpression of PRR5， the accumulation of anthocyanin and the expression of some anthocyanin synthesis－related genes were significantly increased. （3） The results of the protein－protein interaction experiment showed that PRR5 protein could interact with MYB75， MYB90， MYB113 and TT8 to form protein complexes. （4） Results of genetic analysis showed that PRR5 promoted anthocyanin synthesis in A. thaliana seedlings depended on the MYB family anthocyanin regulatory proteins. In conclusion， the circadian clock PRR protein may promote the synthesis and accumulation of anthocyanin in A. thaliana seedlings through the interaction of PRR5 protein with MYB75， TT8.

Key words：

Arabidopsis thaliana， circadian clock， PRR protein， anthocyanin， MBW complex

花青素又稱花色素苷，是植物次級代謝產物，在花、果實和葉片等植物器官中廣泛存在（Liang et al.， 2018; Song et al.， 2021）。植物體內六類花青素即天竺葵素（pelargonidin）、矢車菊素（cyanidin）、芍藥素（peonidin）、矮牽牛素（petunidin）、飛燕草素（delphinidin）和錦葵素（malvidin）通過糖基化、甲基化和?；刃揎椬饔蒙?00余種花青素，從而賦予植物豐富的色彩（Li et al.， 2018; Wang et al.， 2018; Gardeli et al.， 2019; Sun et al.， 2021）?；ㄇ嗨乜梢蕴岣咧参飳Χ喾N逆境脅迫的抵抗能力，對植物適應環境具有重要意義（Hatier et al.， 2013; Fan et al.， 2016; Li et al.， 2018）。此外，花青素具有豐富的觀賞價值、營養價值和醫藥價值（Davies et al.， 2012; Peiffer et al.， 2016; Nomi et al.， 2019）。編碼花青素生物合成通路中相關酶的結構基因主要分為兩類：CHS、CHI和F3H等早期花青素生物合成基因；DFR、ANS和UFGT等晚期花青素生物合成基因（Deng & Lu， 2017; Chen et al.， 2020）。這些結構基因受到多種轉錄因子的精密調控，其中被研究最多也是最重要的分別是MYB（Myeloblastosis）、bHLH（basic Helix－Loop－Helix）和WDR（又稱WD40）三類轉錄因子家族（Tanaka et al.， 2008）。MYB75/PAP1是擬南芥MYB蛋白家族中調控花青素合成的重要轉錄因子，過表達MYB75轉基因植物的根、莖、葉和花中積累了大量花青素（Rinaldo et al.， 2015; Shin et al.， 2015）。此外，MYB家族MYB90/PAP2、MYB113和MYB114還正調控擬南芥花青素的生物合成（Gonzalez et al.， 2008; Maier et al.， 2013; Shi & Xie， 2014）。bHLH蛋白家族TT8、GL3、EGL3和MYC1等通過激活CHS、DFR等結構基因的表達，參與調控花青素的合成（Martinez－Garcia et al.， 2000）。WDR蛋白家族TTG1等是誘導花青素穩定積累不可或缺的一類重要轉錄因子（Payne et al.， 2000）。MYB、bHLH和WDR三類轉錄因子除了可以各自發揮功能促進植物花青素的合成以外，三者還可以結合形成三元MBW復合體直接調控結構基因的表達促進植物花青素的合成（Liang et al.， 2018）。越來越多的研究結果表明，microRNA直接或間接地參與調控植物體內花青素的合成（Varsha et al.， 2019; He et al.， 2019; Maria et al.， 2019）。基于花青素的生物學功能及其在育種、食品和醫藥等方面的應用前景，深入研究花青素生物合成與調控信號具有重要的應用價值和科學意義。

近年來，外源環境信號及內源植物激素信號調控花青素生物合成與積累的研究取得了重要進展。例如，光強和光質均對花青素的合成起關鍵作用（Guo et al.， 2008; Maier & Hoecker， 2015）；低溫促進花青素的生物合成（Mori et al.， 2007; Zhang et al.， 2011）；植物激素脫落酸、茉莉酸、生長素等通過調控花青素合成相關基因的表達來影響植物花青素的合成與積累（Ji et al.， 2015; Xie et al.， 2016; Chen et al.， 2019; Chen et al.， 2020）。植物生物鐘系統通過核心振蕩器接收外界環境中如光照、溫度和營養元素等環境因子動態變化的時間信息（輸入途徑），在植物體內產生內源性的晝夜節律（中央振蕩器），進而調控植物生長發育的眾多過程，如開花、生物和非生物脅迫響應、激素代謝等多種生命過程（輸出途徑）（Wei et al.， 2018）。PRR家族中的PRR5、PRR7和PRR9是中央振蕩器早循環的關鍵組分，在調控植物生長發育和響應逆境脅迫方面發揮了重要作用（Sanchez & Kay， 2016）。生物鐘與花青素均在植物響應逆境脅迫中發揮重要功能（Wei et al.， 2018; Song et al.， 2021），但關于生物鐘信號調控花青素合成的研究尚未見報道。近期有研究表明，生物鐘PRR蛋白能夠促進ABA信號抑制種子萌發及萌發后生長（Yang et al.， 2021），而ABA信號可以誘導擬南芥幼苗中花青素的合成與積累（Chen et al.， 2020）。那么，生物鐘PRR蛋白是否與花青素合成直接相關呢？本研究以擬南芥為材料，通過分子生物學和遺傳學相關的方法，探究了生物鐘PRR蛋白促進擬南芥幼苗花青素合成的生物學功能及其分子機制。這對于發掘PRR蛋白新的生物學功能，深入理解生物鐘信號調控植物幼苗的環境適應性具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 植物材料及生長條件

所使用的野生型（WT）、突變體和過表達擬南芥植物均屬于哥倫比亞（Col－0）遺傳背景，突變體種子prr5－1（SALK_006280）、prr5－2（SALK_135000C）、prr7－1（SALK_091569C）和prr7－2（SALK_030430C）來源于俄亥俄州立大學的擬南芥資源中心，prr5 prr7雙突變體是通過prr5－1和prr7－2采用遺傳雜交得到，prr5 prr9和prr5 prr7 prr9由中國科學院植物研究所王雷研究員提供，myb－RNAi由楊洪全教授提供。為了獲得35S：PRR5－FLAG轉基因植株，將2FLAG標簽序列連接的PRR5全長cDNAs，使用SmaI和XbaI酶切位點克隆到由CaMV 35S啟動的pOCA30載體，經農桿菌轉化野生型（Col－0）擬南芥獲得T3代純合PRR5過表達植物（Yang et al.， 2021）。根據需要選取適量擬南芥突變體種子、過表達種子和野生型種子，加入20%種子消毒液（立白白衣漂漬液）浸泡8 min，使用無菌水清洗3～5次，播種于含有1%（m/V）蔗糖的1/2 MS固體培養基上（pH 5.8）。4 ℃處理24 h后，轉移到光照培養間長日照條件下（全天22 ℃，白光光照16 h，黑暗8 h）培養8 d左右，移栽至濕潤土壤中。使用保鮮膜覆蓋幼苗，放置在培養間長日照條件下，2～3 d后揭膜繼續培養。

1.2 花青素含量的測定

在長日照條件下生長6 d的擬南芥幼苗（包括Col－0、prr5－1、prr5－2、prr7－1、prr7－2、prr5 prr7、prr5 prr9、prr5 prr7 prr9和35S：PRR5－FLAG等），于當天光照的第10個小時（ZT 10）進行取樣并稱重（g），加入1 mL花青素提取液（甲醇、鹽酸體積比為99∶1）。4 ℃黑暗條件下振蕩24 h，13 000 r·min－1離心10 min后吸取上清液。以花青素提取液作為空白對照，使用分光光度計測量上清液在530、657 nm波長處的吸光度（A530和A657）。花青素相對含量用公式（A530-0.25×A657）g －1 FW計算（Chen et al.， 2020）。實驗至少進行3次生物學重復。

1.3 擬南芥RNA提取和RT－qPCR

在長日照條件下生長6 d的擬南芥幼苗，于當天光照的第10個小時（ZT 10）進行取樣，使用Trizol試劑提取擬南芥幼苗總RNA，逆轉錄成cDNA后進行RT－qPCR反應（Han et al.， 2020）。用于RT－qPCR實驗的引物如表1所示，基因表達的內參使用擬南芥ACTIN2基因。實驗至少進行3次生物學重復。

1.4 酵母雙雜交實驗 （Y2H）

使用酵母雙雜交系統（Hu et al.， 2019）篩選可能與生物鐘PRR蛋白相互作用的花青素合成調控蛋白。將PRR5、PRR7與PRR9的全長編碼序列克隆到pGBKT7載體，構建質粒BD－PRR5、BD－PRR7和BD－PRR9，并構建分段質粒BD－PRR51-180、BD－PRR5172-558和BD－PRR5502-558（Yang et al.， 2021）。將花青素合成調控蛋白MYB75、MYB90、MYB113、MYB114和TT8的全長編碼序列克隆到pGADT7載體，構建質粒AD－MYB75、AD－MYB90、AD－MYB113、AD－MYB114和AD－TT8，并構建分段質粒AD－MYB75－N（第1至第122個氨基酸）、AD－MYB75－C（第123至第249個氨基酸）、AD－TT8－N（第1至第358個氨基酸）和AD－TT8－C（第359至第519個氨基酸）（Xie et al.， 2016; Chen et al.， 2020）。構建酵母雙雜交實驗所需克隆的引物如表2所示。

1.5 雙分子熒光互補實驗（BiFC Assays）

將PRR5、PRR51-180、GUS的編碼序列融合于pFGC－cYFP（Kim et al.， 2008）中，構建質粒PRR5－cYFP、PRR51-180－cYFP和GUS－cYFP。將MYB75、MYB90、MYB113、TT8和GUS的編碼序列融合于pFGC－nYFP（Kim et al.， 2008）中，構建質粒MYB75－nYFP、MYB90－nYFP、MYB113－nYFP、TT8－nYFP和GUS－nYFP。將構建好的質粒轉化到農桿菌（菌株為GV3101）中，取不同菌液（OD值為1.0）按1∶1體積比混合均勻，注射到生長狀態良好的本氏煙草（Nicotiana benthamiana）葉片中，在避光、濕潤的環境中放置48 h后，使用激光共聚焦顯微鏡（Olympus， Tokyo， Japan）觀察YFP和DAPI熒光（Yang et al.， 2021）。構建BiFC實驗所需克隆的引物如表2所示。

1.6 基因ID

所涉及的擬南芥基因的ID：PRR5、AT5G24470；PRR7、AT5G02810；PRR9、AT2G46790；MYB75、AT1G56650；MYB90、AT1G66390；MYB113、AT1G66370；MYB114、AT1G66380；TT8、AT4G09820；DFR、AT5G42800；LDOX、AT4G22880；UF3GT、AT5G54060。以上基因序列信息均可在The Arabidopsis Information Resource（TAIR）網站中獲取。

2 結果與分析

2.1 prr5與prr7突變體幼苗中花青素含量降低

為探究生物鐘蛋白PRR是否能參與調控植物花青素的合成，觀察在1/2 MS培養基上生長6 d的野生型（WT）、prr5－1、prr5－2、prr7－1和prr7－2突變體擬南芥幼苗。圖1結果顯示，與野生型相比，prr5－1、prr5－2、prr7－1和prr7－2突變體幼苗中花青素積累明顯降低，表現為突變體幼苗莖尖顏色更淺（圖1：A）。通過花青素含量測定，發現與觀察到的表型相一致，野生型幼苗的花青素含量最高，prr5－1、prr5－2、prr7－1和prr7－2突變體幼苗的花青素含量顯著低于野生型幼苗，且prr5－1和prr5－2突變體幼苗的花青素含量較prr7－1和prr7－2突變體幼苗更低（圖1：B）。這表明當PRR5和PRR7突變后，幼苗中花青素含量降低，即PRR5和PRR7可能誘導植物幼苗花青素的積累。為進一步驗證該結果，檢測了相關結構基因DFR、UF3GT和LDOX的表達情況。DFR、UF3GT和LDOX是編碼花青素合成通路中關鍵酶的結構基因，這些基因的表達直接激活花青素的生物合成，從而促進擬南芥花青素的積累。提取WT、prr5－1、prr5－2、prr7－1和prr7－2突變體幼苗總RNA后逆轉錄cDNA，并進行RT－qPCR實驗，檢測DFR等結構基因的相對表達量。prr5－1、prr5－2、prr7－1和prr7－2突變體幼苗中DFR、UF3GT和LDOX基因的表達量顯著降低（圖1：C-E）。這表明PRR5和PRR7能夠通過誘導擬南芥幼苗中DFR等結構基因的表達促進花青素的積累。

2.2 PRR5、PRR7和PRR9協同促進幼苗花青素的積累

為確定PRR5、PRR7和PRR9蛋白是否協同調控花青素生物合成，觀察了prr5 prr7、prr5 prr9和prr5 prr7 prr9等多突變體幼苗的花青素積累表型。圖2結果顯示，與野生型相比，prr雙突變和三突變體幼苗的花青素積累明顯更低，其中prr5 prr7 prr9三突變體幼苗花青素積累最低，prr5 prr7雙突變體幼苗花青素積累低于prr5 prr9雙突變體（圖2：A），通過花青素含量測定，結果與觀察到的表型相一致（圖2：B）。與prr5－1、prr5－2、prr7－1和prr7－2等單突變體相比（圖1：A，B），prr5 prr7和prr5 prr7 prr9幼苗花青素含量顯著降低，其中prr5 prr9雙突變體幼苗花青素含量略低于prr5－1和prr5－2單突變體（圖2：A，B）。檢測相關結構基因DFR、UF3GT和LDOX的表達，與野生型相比，prr雙突變和三突變體幼苗中相關基因的表達量明顯更低，其中在prr5 prr7 prr9三突變體幼苗中表達量最低，在prr5 prr7雙突變體幼苗中的表達量低于prr5 prr9雙突變體（圖2：C-E）。這表明PRR5、PRR7和PRR9協同促進幼苗花青素的積累，prr5 prr7 prr9三突變體幼苗花青素積累更低。

2.3 過表達PRR5使幼苗中花青素含量升高

為進一步確定PRR蛋白調控植物花青素合成的生物學功能，構建了CaMV35S啟動子驅動的過表達PRR5轉基因植物35S：PRR5－FLAG（Yang et al. 2021），篩選出表達量較高的3個純合株系（35S：PRR5－FLAG－9、35S：PRR5－FLAG－10和35S：PRR5－FLAG－15）并檢測其幼苗花青素含量。如圖3：A，B所示，與野生型相比，35S：PRR5－FLAG－9、35S：PRR5－FLAG－10和35S：PRR5－FLAG－15幼苗中花青素的積累顯著升高，表現為莖尖的顏色加深，呈現出明顯的紫紅色。PRR5過表達轉基因植物幼苗中DFR、UF3GT和LDOX基因的相對表達量顯著高于野生型（圖3：C-E）。這進一步證實了生物鐘蛋白PRR確實能夠促進植物幼苗花青素的積累。

2.4 MYB75和TT8蛋白與PRR5蛋白相互作用

為探究生物鐘PRR蛋白調控擬南芥幼苗花青素合成的分子機理，使用酵母雙雜交系統（Y2H）篩選可能與PRR蛋白相互作用的花青素合成相關蛋白。將PRR5、PRR7和PRR9與誘餌載體Gal4 DNA結合域載體相融合（BD－PRR5等），MYB75、MYB90、MYB113、MYB114和TT8等花青素合成相關蛋白與獵物載體的Gal4 DNA激活域融合（AD－MYB75等）。通過酵母雙雜交實驗表明，MYB75和TT8蛋白與PRR5蛋白在酵母中發生強相互作用，而MYB90、MYB113蛋白與PRR5蛋白在酵母中相互作用則較弱（圖4）。

為進一步驗證MYB75、MYB90、MYB113和TT8蛋白與PRR5蛋白的相互作用，使用雙分子熒光互補實驗（BiFC）在植物體內進行檢測分析。將PRR5與CaMV35S啟動子驅動的C端黃色熒光蛋白（c－YFP）片段融合形成PRR5－cYFP，并將MYB75、MYB90、MYB113和TT8與N端YFP片段融合獲得MYB75－nYFP、 MYB90－nYFP、 MYB113－分別表示與WT比較有顯著差異（P＜0.05）和極顯著差異（P＜0.01）。下同。

nYFP和TT8－nYFP。將PRR5－cYFP與MYB75－nYFP、MYB90－nYFP、MYB113－nYFP或TT8－nYFP共轉化到煙草葉片中，在煙草細胞核內檢測到強烈的熒光信號，而在相關的對照組中卻未觀察到熒光信號（圖5）。這說明PRR5能與花青素合成相關的MYB75、MYB90、MYB113和TT8蛋白在植物細胞核內相互作用形成復合物。

2.5 MYB75和TT8蛋白與PRR5蛋白相互作用的結構域

為確定PRR5蛋白與MYB75、MYB90、MYB113和TT8蛋白相互作用所必需的區域，將突變的PRR5序列融合到Gal4 DNA結合域載體作為誘餌，并進行了酵母雙雜交分析。如圖6：A所示，PRR5蛋白的PR結構域（BD－PRR51-180）與CCT結構域（BD－PRR5502-558）不與MYB75、MYB90、MYB113和TT8蛋白相互作用，而PRR5蛋白C端片段（BD－PRR5172-558）與MYB75、MYB90、MYB113和TT8蛋白相互作用。這表明PRR5的C端氨基酸結構域介導了PRR5蛋白與MYB75、MYB90、MYB113和TT8蛋白之間的相互作用。同時，將在酵母中與PRR5蛋白強相互作用的MYB75和TT8蛋白突變為N端和C端，融合到Gal4 DNA激活域載體，并進行酵母雙雜交分析。如圖6：B-C所示，當MYB75和TT8蛋白的N端缺失時，它們不能與PRR5蛋白相互作用。這表明MYB75和TT8蛋白的N端氨基酸結構域介導了它們與PRR5蛋白之間的相互作用。

2.6 PRR5促進花青素的合成依賴于MYB家族花青素調控蛋白

前期研究發現，PRR蛋白與花青素合成相關的MYB75、MYB90、MYB113和TT8蛋白相互作用誘導花青素合成，進一步通過遺傳學實驗分析了PRR5促進花青素的合成是否依賴于MYB家族花青素調控蛋白的功能。通過擬南芥遺傳雜交的方法，構建了myb－RNAi 35S：PRR5－FLAG的雜交材料，獲得了F3代純合植物，并分析了花青素積累的表型。如圖7所示，與myb－RNAi突變體表型一致，myb－RNAi 35S：PRR5－FLAG雜交材料幼苗中花青素的積累顯著下降，表現為莖尖的顏色較淺（圖7：A），通過花青素含量測定，所得結果與觀察到的表型相一致（圖7：B）。這表明PRR5促進花青素的合成依賴于MYB家族花青素調控蛋白。

3 討論與結論

生物鐘系統使植物可以感知和預測環境因子的周期性變化，以協調體內代謝穩態、生長發育與防御反應的動態平衡，使植物在合適的時間完成其關鍵生長發育過程（Greenham & McClung， 2015; Wei et al.， 2018）。生物鐘PRR蛋白家族在調控植物生長發育和響應逆境脅迫方面發揮了重要作用，影響幼苗光形態建成，增強擬南芥對寒冷、 干旱和鹽的耐受性等 （Kreps et al.， 2002;

Kaczorowski & Quail， 2003; Keily et al.， 2013; Liu et al.， 2013）。Yang等（2021）研究表明，生物鐘PRR蛋白在種子萌發及萌發后生長過程中促進ABA信號，在白天抑制種子萌發及萌發后生長?；ㄇ嗨卦谥参锏挚苟喾N逆境脅迫中發揮重要作用，由MYB、bHLH和WDR三類轉錄因子形成的MBW復合體是其生物合成中最關鍵的轉錄調控因子（Liang et al.， 2018; Li et al.， 2018）。外源環境信號如光照、溫度及內源植物激素信號脫落酸、茉莉酸等可以通過調控花青素合成相關基因的表達影響花青素生物合成與積累（Mori et al.， 2007; Guo et al.， 2008; Xie et al.， 2016; Chen et al.， 2020）。

本研究發現，生物鐘PRR基因突變后擬南芥幼苗中花青素含量降低。進一步分析PRR基因雙突變體和三突變體幼苗的表型，發現PRR5、PRR7和PRR9協同促進幼苗花青素的積累。對PRR基因相關突變體進行RT－qPCR實驗分析結果表明，花青素合成通路重要結構基因DFR、UF3GT和LDOX的相對表達量顯著降低，并與花青素積累表型趨勢一致。通過構建PRR5基因過表達轉基因植物且檢測其幼苗花青素含量發現，過表達PRR5轉基因植物幼苗的花青素含量顯著高于野生型。因此，本研究認為生物鐘PRR蛋白能夠通過調控某些花青素合成結構基因的表達來促進幼苗中花青素的合成。通過酵母雙雜交與BiFC實驗表明，PRR5蛋白能與花青素合成調控蛋白MYB75、MYB90、MYB113和TT8相互作用。擬南芥中的PRR蛋白家族屬于CCT（CONSTANS/CONSTANSLIKE/TOC1）大家族，它們都具有N端的PRR/RLD（RECEIVER LIKE DOMAIN）結構域和C端的CCT結構域（Farre & Liu， 2013）。通過分段實驗發現，PRR5蛋白N端的PRR結構域和C端的CCT結構域均不能與MYB75等調控蛋白相互作用，而包含CCT結構域的C端結構域卻介導了PRR5與MYB75等調控蛋白的相互作用。本研究還確認了與PRR5強相互作用的MYB75、TT8蛋白的N端介導了它們與PRR5蛋白的互作。因此，本研究認為生物鐘PRR5蛋白能夠與花青素合成調控蛋白MYB75、MYB90、MYB113和TT8等互作形成復合物。進一步構建myb－RNAi 35S：PRR5－FLAG雜交材料后發現，其幼苗的花青素含量與myb－RNAi突變體基本一致，表明PRR5促進花青素的合成依賴于MYB家族花青素調控蛋白。

本研究認為擬南芥生物鐘PRR蛋白能夠促進幼苗中花青素的積累，并且可能通過PRR5與MBW復合體相互作用調控花青素的合成。本研究發現了生物鐘信號與花青素合成的聯系，初步揭示了生物鐘PRR蛋白促進擬南芥幼苗花青素合成的調控機制，對于深入理解生物鐘信號調控植物環境適應性具有重要意義。種子萌發直至幼苗形態建成是植物生命周期中關鍵的發育階段，也是植物適應環境最敏感的階段之一，極易受到外界逆境環境的脅迫而死亡。擬南芥種子屬于需光型種子，只有在土壤表層才能萌發生長，幼苗在白天更易受到強光、干旱等環境的脅迫。花青素是植物天然的光保護劑，同時能夠增強植物抗旱的能力（Guo et al.， 2008; Ahmed et al.， 2014）。本研究認為生物鐘PRR蛋白促進幼苗花青素的合成與積累，以保護植物抵御白天可能的強光、干旱等逆境脅迫；同時PRR在白天抑制種子萌發和幼苗下胚軸伸長（Li et al.， 2020; Yang et al.， 2021），以協調防御反應和生長發育的動態平衡，使植物安全渡過關鍵生長發育過程。然而，PRR蛋白通過MBW復合體調控花青素合成的分子機制仍需進一步解析，生物鐘PRR蛋白促進幼苗花青素合成的生物學功能在不同物種中是否具有保守性還需深入研究，這對于培育優良品種以及作物生產具有重要意義。生物鐘系統其他蛋白是否參與調控花青素合成也有待進一步探索。

參考文獻：

AHMED NU， PARK JI， JUNG HJ， et al.， 2014. Characterization of dihydroflavonol 4－reductase （DFR） genes and their association with cold and freezing stress in Brassica rapa ［J］. Gene， 550（1）： 46-55.

CHEN JJ， MEI S， HU YR， 2020.Abscisic acid induces anthocyanin synthesis in Arabidopsis thaliana seedlings ［J］. Guihaia， 40（8）： 1169-1180.［陳俊潔， 梅松， 胡彥如， 2020. 脫落酸激素誘導擬南芥幼苗中花青素的合成 ［J］. 廣西植物， 40（8）： 1169-1180.］

CHEN LH， HU B， QIN YH， 2019. Advance of the negative regulation of anthocyanin biosynthesis by MYB transcription factors ［J］. Plant Physiol Biochem， 136（7）： 178-187.

DAVIES KM， ALBERT NW， SCHWINN KE， 2012. From landing lights to mimicry： the molecular regulation of flowercolouration and mechanisms for pigmentation patterning ［J］. Funct Plant Biol， 39（8）： 619-638.

DENG YX， LU SF， 2017. Biosynthesis and regulation of phenylpropanoids in plants ［J］. Crit Rev Plant Sci， 36（4）： 257-290.

FAN XP， FAN BH， WANG YX， et al.， 2016.Anthocyanin accumulation enhanced in Lc－transgenic cotton under light and increased resistance to bollworm ［J］. Plant Biotechnol Rep， 10： 1-11.

GARDELI C， VARELA K， KROKIDA E， et al.， 2019. Investigation of anthocyanins stability from pomegranate juice （Punica granatum L. cv Ermioni） under a simulated digestion process ［J］. Medicines， 6（3）： 90.

GONZALEZ A， ZHAO M， LEAVITT JM， et al.， 2008. Regulation of the anthocyanin biosynthetic pathway by the TTG1/bHLH/Myb transcriptional complex in Arabidopsis seedlings ［J］. Plant J， 53（5）： 814-827.

GREENHAM K， MCCLUNG CR， 2015. Integrating circadian dynamics with physiological processes in plants ［J］. Nat Rev Genet， 16（10）： 598-610.

GUO J， HAN W， WANG MH， 2008. Ultraviolet and environmental stresses involved in the induction and regulation of anthocyanin biosynthesis： A review ［J］. Afr J Biotechnol， 7（25）： 4966-4972.

HAN X， ZHANG MH， YANG ML， et al.， 2020. Arabidopsis JAZ proteins interact with and suppress RHD6 transcription factor to regulate Jasmonate－stimulated root hair development ［J］. Plant Cell， 32（4）： 1049-1062.

HATIER JHB， CLEARWATER MJ， GOULD KS， 2013. The functional significance of black－pigmented leaves： photosynthesis，photoprotection and productivity in Ophiopogon planiscapus ‘Nigrescens ［J］. PLoS ONE， 8（6）： e67850.

HE LH， TANG RM， SHI XW， et al.， 2019. Uncovering anthocyanin biosynthesis related microRNAs and their target genes by small RNA and degradome sequencing in tuberous roots of sweetpotato ［J］. BMC Plant Biol， 19： 232.

HU YR， HAN X， YANG ML， et al.， 2019. The transcription factor INDUCER OF CBF EXPRESSION1 interacts with ABSCISIC ACID INSENSITIVE5 and DELLA proteins to fine－tune abscisic acid signaling during seed germination in Arabidopsis ［J］. Plant Cell， 31（7）： 1520-1538.

JI XH， WANG YT， ZHANG R， et al.， 2015. Effect of auxin， cytokinin and nitrogen on anthocyanin biosynthesis in callus cultures of red－fleshed apple ［J］. Plant Cell Tiss Organ Cult， 120（1）： 325-337.

KACZOROWSKI KA， QUAIL PH， 2003. Arabidopsis PSEUDO－RESPONSE REGULATOR7 is a signaling intermediate in phytochrome－regulated seedling deetiolation and phasing of the circadian clock ［J］. Plant Cell， 15（11）： 2654-2665.

KEILY J， MACGREGOR DR， SMITH RW， et al.， 2013. Model selection reveals control of cold signalling by evening－phased components of the plant circadian clock ［J］. Plant J， 76（2）： 247-257.

KREPS JA， WU YJ， CHANG HS， et al.， 2002. Transcriptome changes for Arabidopsis in response to salt， osmotic， and cold stress ［J］. Plant Physiol， 130（4）： 2129-2141.

LI N， ZHANG YY， HE YQ， et al.， 2020. Pseudo response regulators regulate photoperiodichypocotyl growth by repressing PIF4/5 transcription ［J］. Plant Physiol， 183（2）： 686-699.

LI SC， GUO JH， REVA A， et al.， 2018. Methyltransferases of gentamicin biosynthesis ［J］. Proc Natl Acad Sci USA， 115（6）： 1340-1345.

LI X， HE YM， XIE CM， et al.， 2018. Effects of UV－B radiation on the infectivity of Magnaporthe oryzae and rice disease－resistant physiology in Yuanyang terraces［J］. Photochem Photobiol Sci， 17（1）： 8-17.

LIANG LJ，YANG YC， WANG EH， et al.， 2018. Research progress on biosynthesis and regulation of plantanthocyanin ［J］. J Anhui Agric Sci， 46（21）： 18-24.［梁立軍， 楊祎辰， 王二歡， 等， 2018. 植物花青素生物合成與調控研究進展 ［J］. 安徽農業科學， 46（21）： 18-24.］

LIU T， CARLSSON J， TAKEUCHI T， et al.， 2013. Direct regulation of abiotic responses by the Arabidopsis circadian clock component PRR7 ［J］. Plant J， 76（1）： 101-114.

MAIER A， HOECKER U， 2015. COP1/SPA ubiquitin ligase complexes repress anthocyanin accumulation under low light and high light conditions ［J］. Plant Signal Behav， 10（1）： e970440.

MAIER A， SCHRADER A， KOKKELINK L， et al.， 2013. Light and the E3 ubiquitin ligase COP1/SPA control the protein stability of the MYB transcription factors PAP1 and PAP2 involved in anthocyanin accumulation in Arabidopsis ［J］. Plant J， 74（4）： 638-651.

MARIA J， LOPEZ G， INMACULADA GR， et al.， 2019. Expression of miR159 is altered in tomato plants undergoing drought stress ［J］. Plants， 8（7）： 201.

MARTINEZ－GARCIA JF， HUQ E， QUAIL PH， 2000. Direct targeting of light signals to a promoter element－bound transcription factor ［J］. Science， 288（5467）： 859-863.

MORI K， GOTO－YAMAMOTO N， KITAYAMA M， et al.， 2007. Loss of anthocyanins in red－wine grape under high temperature ［J］. J Exp Bot， 58（8）： 1935-1945.

NOMI Y， IWASAKI－KURASHIGE K， MATSUMOTO H， 2019. Therapeutic effects of anthocyanins for vision and eye health ［J］. Molecules， 24（18）： 3311.

PAYNE CT， ZHANG F， LLOYD AM， 2000. GL3 encodes a bHLH protein that regulates trichome development in Arabidopsis through interaction with GL1 and TTG1 ［J］. Genetics， 156（3）： 1349-1362.

PEIFFER DS， WANG LS， ZIMMERMAN NP， et al.， 2016. Dietary consumption of black raspberries or their anthocyanin constituents alters innate immune cell trafficking in esophageal cancer ［J］. Cancer Immunol Res， 4（1）： 72-82.

RINALDO AR， CAVALLINI E， JIA Y， et al.， 2015. A grapevine anthocyanin acyltransferase， transcriptionally regulated by VvMYBA， can produce most acylated anthocyanins present in grape skins ［J］. Plant Physiol， 169（3）： 1897-1916.

SANCHEZ SE， KAY SA， 2016. The plant circadian clock： from a simple timekeeper to a complex developmental manager ［J］. Cold Spring Harb Perspect Biol， 8（12）： a027748.

SHI MZ， XIE DY， 2014. Biosynthesis and metabolic engineering of anthocyanins in Arabidopsis thaliana ［J］. Recent Pat Biotechnol， 8（1）： 47-60.

SHIN DH， CHO M， CHOI MG， et al.， 2015. Identification of genes that may regulate the expression of the transcription factor production of anthocyanin pigment 1 （PAP1）/MYB75 involved in Arabidopsis anthocyanin biosynthesis ［J］. Plant Cell Rep， 34（5）： 805-815.

SONG JH， GUO CK， SHI M， 2021. Anthocyanin biosynthesis and transcriptional regulation in plant ［J］. Mol Plant Breed， 19（11）： 3612-3620.［宋建輝， 郭長奎， 石敏， 2021. 植物花青素生物合成及調控 ［J］. 分子植物育種， 19（11）： 3612-3620.］

SUN Q， HUANG MY， WEI YQ， 2021. Diversity of the reaction mechanisms of SAM－dependent enzymes ［J］. Acta Pharm Sin B， 11（3）： 632-650.

TANAKA Y， SASAKI N， OHMIYA A， 2008. Biosynthesis of plant pigments：anthocyanins， betalains and carotenoids ［J］. Plant J， 54（4）： 733-749.

VARSHA T， CHENNA S， ASHWIN N， et al.， 2019. MiR828 and miR858 regulate VvMYB114 to promote anthocyanin and flavonol accumulation in grapes ［J］. J Exp Bot， 70（18）： 4775-4792.

WANG HX， WANG CY， FAN WJ， et al.， 2018. A novel glycosyltransferase catalyses the transfer of glucose to glucosylated anthocyanins in purple sweet potato ［J］. J Exp Bot， 69（22）： 5444-5459.

WEI H， WANG Y， LIU BH， et al.， 2018. Deciphering the underlying mechanism of the plant circadian system and its regulation on plant growth and development ［J］. Bull Bot， 53（4）： 456-467.［魏華， 王巖， 劉寶輝， 等， 2018. 植物生物鐘及其調控生長發育的研究進展 ［J］. 植物學報， 53（4）： 456-467.］

XIE Y， TAN HJ， MA ZX， et al.， 2016. DELLA proteins promoteanthocyanin biosynthesis via sequestering MYBL2 and JAZ suppressors of the MYB/bHLH/WD40 complex in Arabidopsis thaliana ［J］. Mol Plant， 9（5）： 711-721.

YANG ML， HAN X， YANG JJ， et al.， 2021. The Arabidopsis circadian clock protein PRR5 interacts with and stimulates ABI5 to modulate abscisic acid signaling during seed germination ［J］. Plant Cell， 33（9）： 3022-3041.

ZHANG YQ， ZHENG S， LIU ZJ， et al.， 2011. Both HY5 and HYH are necessary regulators for low temperature－inducedanthocyanin accumulation in Arabidopsis seedlings ［J］. J Plant Physiol， 168（4）： 367-374.

（責任編輯 蔣巧媛）