中國滇南地區蓮霧炭疽病病原菌的形態學和分子生物學鑒定

李維峰， 何鵬搏， 陳紅梅， 夭瑩云， 李晶萍，于龍鳳， 曲鵬， 葛宇， 譚萬忠

1. 云南農業大學 熱帶作物學院，云南 普洱 665099；2. 云南農業大學 植物保護學院，昆明 650210；3. 滇西科技師范學院 生物科學與技術學院，云南 臨滄 677000

蓮霧Syzygiumsamarangense又名洋蒲桃, 為桃金娘科Myrtaceae常綠喬木植物, 原產地為馬來西亞及印度, 在東南亞各國廣泛栽培, 于17世紀后期被引入中國臺灣省, 20世紀30年代引入中國內地, 現在海南、 廣東、 廣西、 福建和云南等地作為水果和綠化植物廣泛種植, 面積大且產量高, 每公頃可收獲果實達13 t以上[1-2], 屬經濟效益高、 生態效益好且發展前景廣闊的熱帶常綠果樹[3-10]． 然而, 蓮霧果樹的病害較多, 影響果實產量與品質, 已報道的主要有炭疽病、 果腐病、 斑點病、 煤污病和藻斑病等10多種重要病害[11-15]． 炭疽病是蓮霧植株上普遍發生和為害嚴重的病害, 在我國蓮霧栽培省區都有發生, 主要為害葉片和儲藏期果實． 李楊秀等[16]采用形態學和分子生物學方法將廣西蓮霧炭疽病的病原菌鑒定為果生刺盤孢菌Colletotrichumfructicola; Obaidi等[17]鑒定了馬來西亞蓮霧炭疽病的病原菌為盤長孢刺盤孢C.gloeosporioides; Udayanga等[18]鑒定了引起泰國蓮霧炭疽病的病原菌為蓮霧刺盤孢C.syzygicola． 可見, 不同地區蓮霧炭疽病病原菌均為刺盤孢屬Colletotrichum真菌, 但具有物種多樣性．

2021年, 課題組在調查云南省普洱市和西雙版納州熱帶果樹病蟲害時, 發現蓮霧炭疽病在各區、 縣果園均嚴重發生, 但該地炭疽病病原菌種類迄今尚無報道． 本研究從該地區不同果園采集炭疽病病葉進行病原菌分離純化、 柯赫氏證病試驗、 形態學和ITS(Internal Jranscribed Spacer)序列分子鑒定, 以明確該地炭疽病菌歸屬, 為病害的有效控制提供科學依據．

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 蓮霧葉樣品

于2021年6月從普洱市、 7月從西雙版納州不同區、 縣采集具有典型炭疽病癥狀的葉片標本, 帶回實驗室用于病原菌分離和純化． 另外, 在普洱市思茅區倚象鎮果園采集健康蓮霧葉片, 用于菌株致病性測試．

1.1.2 培養基

采用北京三藥科技開發公司生產的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(PDA), 使用時按1 000 mL培養液中含37 g PDA粉制作平板和斜面培養基, 用于菌種的分離純化和保存．

1.1.3 引物

采用通用引物ITS1/ITS2擴增病菌的基因組rDNA-ITS片段, 引物序列為(5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’/(5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)[19], 由昆明碩擎生物技術有限公司合成．

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分離純化

對兩個地區采集的病樣, 分別采用病斑組織培養分離法分離和純化病原真菌菌株處理[20]． 消毒過的染病組織置于直徑15 cm的培養皿平板上, 放入25 ℃恒溫箱中培養72 h, 從菌落邊緣挑取尖端菌絲到新的PDA平板培養基中央, 在25 ℃恒溫箱中培養96 h, 得到純化培養菌株, 再將其轉移到PDA試管斜面上培養48 h后, 于-4 ℃冰箱中保存備用．

1.2.2 病害癥狀記述

結合野外調查和后續室內接種試驗觀察, 記述不同時期的病害癥狀變化．

1.2.3 致病性試驗

按照柯赫氏證病法則進行試驗[21-22]． 在每個15 cm培養皿底部墊一層濕濾紙, 濾紙上放入1片健康蓮霧葉片, 用針尖輕輕刺傷葉片兩側適當位點后分別接種3個約4×4 mm的菌餅, 然后蓋上培養皿, 在室溫(16～26 ℃)和避光下保濕(RH>90%)48 h后, 移去菌絲餅, 再繼續培養20 d, 每天定時觀察記錄發病情況． 每個菌株接種處理5片葉(重復)． 取接種10 d后的病斑做再分離和菌株純化, 每個菌株分離5個病斑． 將得到的新分離純化菌株與原接種菌株做形態比較, 確定其為同一性．

1.2.4 病原菌形態學觀察和鑒定

經柯赫氏證病試驗確認為病原菌的菌株, 在PDA平板培養基上25 ℃培養至14 d, 在此期間定時觀察拍攝記錄菌落的形態; 待病菌產孢后制作臨時玻片, 在顯微鏡下觀察拍攝分生孢子形態, 并在放大400×狀態下測量50個孢子的長和寬． 根據病菌主要形態學特征參考有關文獻[23-30]進行初步鑒定．

1.2.5 病原菌的聚合酶鏈式反應(PCR)鑒定

收取PDA平板培養基上培養7 d的病菌菌絲體, 用CTAB法[31]分別提取DNA, 用ITS1/ITS4引物對作為PCR擴增引物． PCR反應體系(25 μL)配方為: 2×EasyTaq PCR SuperMix 12 μL、 引物各1 μL、 模板DNA 1 μL、 ddH2O 10 μL． PCR擴增程序設置為: 94 ℃預變性5 min; (94 ℃變性1 min, 55 ℃退火1 min)循環32次; 最后72 ℃延伸4 min． PCR產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳確認后送昆明碩擎生物技術有限公司回收和測序． 將獲得的病原菌rDNA-ITS序列上傳到美國國家生物技術信息中心(NCBI) GenBank數據庫獲得登錄號, 在線(https: //blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)進行Blast-n比對, 并用MEGA6.0軟件[32]做系統演化樹進一步分析, 從GenBank中已注冊的刺盤孢屬選擇下載12種真菌菌株的ITS序列和1種非刺盤孢屬真菌菌株ITS序列作為外源菌株繪制系統演化樹, 結合形態學鑒定結果、 演化樹聚集分枝位置及其置信限確定新分離菌株的分類學種名．

2 結果與分析

2.1 病害癥狀

該病害在蓮霧果園發病普遍, 植株中、 下部老葉片受害較重． 發病初期葉片上形成黃色斑紋, 或形成一些淺黃白色、 圓形或橢圓形的小病斑． 典型病斑呈橢圓形或不規則形, 中央區域灰白色, 周圍有褐色帶、 黃色帶暈圈, 中部壞死組織干枯后脫落形成穿孔(圖1a,b,c)． 在適合的條件下, 葉片上的病斑擴大、 聯合形成不規則較大病斑或大面積枯死(圖1b,d,e)． 發病嚴重時, 病樹可見枯枝和落葉, 生長發育明顯受阻, 結果少、 果小或不結果． 病菌在果實成熟期侵染, 果實表面形成不同大小的圓形、 淺褐色至黑褐色病斑, 均勻地輪紋狀下陷, 越是病斑中央下陷越深． 病斑周緣為淡灰黃色帶, 若遇陰雨天氣或空氣濕度較高時, 病部果肉腐爛, 可引起大量落果, 病果在運輸途中或儲藏期間很容易發生腐爛變質．

2.2 菌株的致病性

通過分離純化, 從普洱市和西雙版納州采集的病樣中各得到3個純化真菌菌株(分別編碼為LWTJ 1,2,3和LB4,5,6), 其中分離自普洱市的LWTJ2和來自西雙版納州的LB4基本相同, 它們與刺盤孢屬真菌的菌落形態近似． 用LWTJ2和LB4離體接種健康蓮霧葉片后癥狀相似, 48 h后菌餅下葉片組織呈水浸狀壞死, 6 d后形成近圓形病斑, 其中央呈灰白色, 周圍黑褐色, 褐色壞死部分外圍有黃色暈圈, 與田間自然發病葉片上典型病斑相似． 在5片葉(重復)上6個接種點全部發病, 發病率為100%． 接種10 d后, 切取病斑組織10塊進行再分離純化, 均成功分離到與原接種菌株菌落形態相同的純培養物(圖2d)． 在相同條件下, 其他4個菌株菌落與刺盤孢屬真菌菌落有差異, 接種后未引起蓮霧葉片發病, 為污染的雜菌． 因此, 根據柯赫氏證病法則確定LWTJ2和LB4菌株為蓮霧炭疽病病原菌．

a. &b. 葉片上的典型病斑; c.& d. 擴展的葉斑或枯斑; e. 室內接種6 d后的葉片病斑．圖1 蓮霧炭疽病自然和接種發病葉片癥狀

2.3 病菌的形態特征與鑒定

LWTJ2和LB4兩個致病菌株在PDA培養基上的培養特征基本相同． 在25 ℃恒溫箱中培養6 d后, 菌落呈圓形, 粉白或鵝黃色, 邊緣光滑齊整, 表面呈絨毛狀, 氣生菌絲發達(圖2a); 后期(12 d)菌落顏色稍加深, 中央區域變成灰黑色, 并產生大量蛋黃色分生孢子團(圖2b)． 在顯微鏡下觀察, 菌絲透明, 分隔, 呈近直角分枝． 分生孢子無色, 呈長橢圓形或柱狀, 兩端盾圓, 絕大多數細胞中間部位有一個油球, 孢子大小為9.8～18.0(平均13.9±2.1) μm × 4.5～6.0(平均5.5 ±1.0) μm(圖2c)． 在實驗室較長期地培養和多次采集蓮霧果園自然發病葉片觀察, 均未發現病菌有性時期的子囊殼及子囊孢子． 病菌的這些形態特征, 與Li等[33]描述的暹羅刺盤孢Colletotrichumsiamense非常接近．

圖2 引起蓮霧炭疽病菌菌落和分生孢子形態特征

2.4 病菌的分子生物學鑒定

通過PCR擴增獲得LWTJ2和LB4兩個菌株的基因組rDNA-ITS片段長度均為545 bp, 在NCBI GenBank的登錄號分別為OL413460和OL963924． Blast-n分析表明這兩個菌株ITS序列的最大相似率為100%, 它們與C.siamenseWZ-365菌株ITS(Acc. No. MN856443)的最大相似率和覆蓋率分別為99.08%和99%, 與C.kahawae(卡哈瓦刺盤孢)的覆蓋率和最大相似率分別為98%和99.63%(圖3a); 用MEGA6.0軟件[32]繪制LWTJ2和LB4兩個菌株ITS與刺盤孢屬12種真菌菌株ITS的系統演化樹圖(圖3b)． 圖3b顯示, 兩個菌株與C.siamenseWZ-365菌株的ITS(Acc. No. MN856443)聚集在同一末端分枝上; LWTJ2和LB4為同一種真菌(置信度為100%), 二者與暹羅刺盤孢為同一物種(置信度為96%)． 因此, 綜合形態特征、 ITS序列Blast-n和演化樹分析確定, 引起蓮霧炭疽病的病原菌為暹羅刺盤孢(C.siamense)．

a. LB4和LWTJ2兩個菌株的ITS序列Blast-n對比分析結果, 從NCBI GenBank在線分析結果表截圖; b. 基于rDNA-ITS序列的LB4和LWTJ2與近緣真菌菌株的系統演化樹, 用MEGA6.0軟件繪制, 圖3b中顯示LWTJ2和LB4(粗體字顯示的蓮霧炭疽病菌菌株)與暹羅刺盤孢菌株(WZ-365)處于演化樹的同一末端分枝上． 相關ITS序列從NCBI GenBank下載而得, 括號內為各菌株ITS序列在NCBI GenBank的登錄號．圖3 蓮霧炭疽病菌的分子鑒定

3 討論與結論

蓮霧是一種被廣泛栽培的重要果樹, 目前文獻記載的蓮霧病害有近60種, 其中炭疽病是發生最普遍和危害最嚴重的一種病害． 蓮霧炭疽病是由刺盤孢屬Colletotrichum真菌侵染所致, 現已報道的有盤長孢刺盤孢C.gloeosporioides、 果生刺盤孢C.fructicola和蓮霧刺盤C.syzygicola[16-18]． 本研究通過形態學和分子生物學鑒定方法確定, 發生在我國云南南部地區的蓮霧炭疽病由暹羅刺盤孢C.siamense引起, 這與其他國家和地區報道的刺盤孢種類不同, 屬于蓮霧炭疽病的一種新病原真菌．

暹羅刺盤孢異名有C.melancaulon,C.dianesei,C.communis,C.endomangiferae,C.hymencallidis及C.jasmini-sambac, 這些異名來源于不同地區的寄主植物[34-38], 均為該真菌的無性型(Anamotph), 在早期的分類系統中屬于真菌界, 半知菌門, 腔孢綱, 黑盤菌目, 黑盤孢科, 刺盤孢屬． 其有性型(Teleomorph)文獻尚無報道, 本研究在室內較長時間反復培養及自然發病果樹上多次觀察尋找均未發現子囊殼和子囊孢子, 說明該真菌可能很難產生有性型． 但依據Sutton[39]文獻記載, 刺盤孢屬中很多種類的有性型均屬于小叢赤殼屬Glomerella, 由此推論暹羅刺盤孢的有性型應該是暹羅小叢殼Glomerellasiamense, 在較新的分類系統中屬于真核域、 真菌界, 雙核菌亞界, 子囊菌門, 子囊菌綱, 小叢赤殼目, 小叢赤殼科, 小叢赤殼屬． 此推論將對今后研究或探索暹羅刺盤孢生活史中的有性型階段和病害循環等具有重要參考作用．

暹羅刺盤孢是一種寄主范圍很廣的植物病原真菌, 現有文獻記載約有60多種炭疽病是由暹羅刺盤孢侵染所致, 國外報道的有菠蘿蜜、 枇杷、 無花果、 薄荷、 胡椒、 迷迭香、 草莓、 辣椒、 柑桔、 火龍果、 蘆薈、 柿子和美國山核桃等作物的炭疽病[40-45]; 我國發生的有柑橘、 蘋果、 核桃、 番木瓜、 荔枝、 胡椒、 假蘋婆、 白蘭花、 鱷梨和越南槐等[46-52]． 本研究鑒定的蓮霧炭疽病也由暹羅刺盤孢所致, 表明蓮霧是暹羅刺盤孢的一個新寄主, 在其他蓮霧種植國家和地區未曾見報道．

據課題組2021年的調查結果, 蓮霧炭疽病在云南省普洱市和西雙版納州各地果園發生普遍, 危害較重, 明顯降低了蓮霧果實產量、 品質及果農的經濟效益． 本研究較詳細地觀察描述了蓮霧炭疽病的癥狀及其病原的形態特征, 鑒定確認了病原菌為暹羅刺盤孢, 不僅對該病害田間診斷識別、 監測和防控有重要的實用參考價值, 而且豐富了蓮霧炭疽病病原菌的多樣性． 然而, 不同植物炭疽病寄主、 病原菌及其發生環境條件各有不同, 它們的流行規律必然存在較大差異, 因此對它們的防控技術措施也會有所不同． 為了減輕或避免蓮霧危害和經濟損失, 促進產業發展, 對于蓮霧炭疽病流行規律、 病原菌生物學特性及其綜合防控技術等方面仍有待進一步研究．

本研究較詳細地觀察記載了滇南地區蓮霧炭疽病癥狀及其病原菌形態特征, 根據形態學與rDNA-ITS序列的Blast-n對比和演化樹分析鑒定獲得的LWTJ2和LB4兩個菌株均屬于暹羅刺盤孢C.siamense, 這是蓮霧炭疽病的一種新病原真菌． 研究結果進一步證明了蓮霧炭疽病病原菌的多樣性, 也為該病害的診斷監測和有效控制提供了科學依據．