基于代謝組學探討補陽還五湯治療腦梗死恢復期氣虛血瘀證的效應機制

趙鐘輝,郭蓉娟,冉 超,朱曉晨

腦卒中是我國成年人致死、致殘的首位病因,具有發病率高、致殘率高、死亡率高和復發率高的特點[1],腦梗死又稱缺血性腦卒中,居腦卒中發病率和死亡率的首位。隨著現代醫學的不斷發展,急性腦梗死病人經積極救治后,存活率明顯提高,但部分人留有偏癱、失語等不同程度的神經功能缺損癥狀的病人進入恢復期,給家庭和社會帶來了嚴重的負擔。有研究表明,腦梗死后3個月內是病人神經功能恢復的最佳階段,因此把握恢復期的治療是提高腦梗死病人生活質量的關鍵[2-3]。現代醫學降低了急性腦梗死病人死亡率,但對腦梗死恢復期的治療目前尚無特效藥物,而中醫藥以特有的優勢廣泛應用于該病的臨床治療中。中醫學認為,腦梗死屬于“中風病”范疇,恢復期多見本虛標實,本虛以氣虛、陰虛為主,標實多為血瘀、痰濕。中醫證候研究顯示,氣虛血瘀證是該病的主要中醫證型[4],益氣活血類中藥治療腦梗死恢復期具有優勢,可改善病人神經功能缺損癥狀,補陽還五湯是治療本病的經典方劑。本研究采用補陽還五湯用于恢復期腦梗死病人,通過臨床療效觀察和代謝組學分析闡釋其療效并對其部分作用機制進行探討。

1 資料與方法

1.1 診斷標準 腦梗死的西醫診斷參照2018年中華醫學會神經病學分會腦血管病學組制定的《中國急性缺血性腦卒中診治指南2018》[5]中的相關內容：急性起病,多為安靜狀態下起病;局灶神經功能缺損(一側肢體或面部麻木或無力,語言障礙等),少數為全面神經功能缺損;影像學顯示有責任缺血性病灶時癥狀或體征持續時間不限,缺乏影像學責任病灶時癥狀或體征持續24 h以上;排除非血管性病因;腦MRI/CT排除腦出血。

中醫診斷參照2015年中華中醫藥學會制定的《中醫臨床診療指南釋義·腦病分冊》[6],①疾病診斷：臨床表現為神志昏蒙、口舌歪斜、半身不遂、言語謇澀或語不達意、甚或不語、偏身麻木;出現眩暈、頭痛、瞳神變化、飲水嗆咳、目偏不瞬、步履不穩等。②病程診斷：急性期為發病2周以內,昏迷者可延長到發病4周;恢復期為發病2周至6個月;后遺癥期為發病6個月后。③氣虛血瘀證證候診斷參照《缺血性中風證候診斷表》[7],通過計算每個證候要素的每項癥狀得分,各項相加得到總評分,氣虛血瘀證診斷標準是氣虛量表評分≥10分,且血瘀量表評分≥10分。

1.2 納入標準

1.2.1 腦梗死恢復期病人納入標準 符合動脈粥樣硬化性腦梗死的西醫診斷標準;符合中風病中經絡中醫診斷標準,辨證為氣虛血瘀證;缺血性中風證候診斷量表氣虛評分≥10分且血瘀評分≥10分;美國國立衛生研究院卒中量表(National Institute of Health Stroke Scale,NIHSS)評分3～22分;年齡40～80歲;發病2周至6個月;病人自愿參與本研究并簽署知情同意書。

1.2.2 健康受試者納入標準 無任何臨床癥狀;年齡40～60歲;與腦梗死恢復期組一般資料匹配;自愿參加并簽署知情同意書。

1.3 排除標準 短暫性腦缺血發作、進展性腦卒中和心源性腦卒中;蛛網膜下腔出血或腦出血;急性期進行過機械取栓或溶栓等血管開通治療;3個月內有過嚴重出血史或有消化性潰瘍等;合并有肝腎功能、血液系統、內分泌系統、循環系統、呼吸系統和風濕免疫系統等嚴重疾病及合并嚴重骨關節性疾病;妊娠期婦女或準備妊娠,尿妊娠試驗陽性,哺乳期婦女;精神障礙、智力障礙病人,昏迷病人,或聾、啞、盲等病人,不能配合檢查;過敏體質或已知對本研究藥物成分過敏;同時參加其他臨床試驗者或3個月內參加過其他臨床試驗。

1.4 一般資料 選取2019年1月—2019年10月于北京中醫藥大學東方醫院腦病科住院及門診就診的腦梗死恢復期氣虛血瘀證病人32例,按照隨機數字表法分為治療組和對照組,各16例,同時招募16名健康受試者。隨訪期間,治療組脫落2例,對照組脫落1例,最終納入治療組14例,對照組15例,健康組16名。治療組,男8例,女6例;年齡(61.64±8.96)歲;病程(4.57±3.06)周;體質指數(25.14±3.76)kg/m2。對照組,男8例,女7例;年齡(62.07±8.71)歲;病程(6.20±5.36)周;體質指數(26.64±3.51)kg/m2。健康組,男10名,女6名;年齡(61.38±7.62)歲;體質指數(26.41±4.88)kg/m2。3組一般資料比較,差異均無統計學意義(P>0.05)。

1.5 治療方法 治療組及對照組均在腦梗死恢復期的常規西醫治療基礎上干預,治療組予以口服補陽還五湯配方顆粒(黃芪60 g,當歸尾20 g,地龍12 g,赤芍15 g,川芎12 g,桃仁12 g,紅花12 g)治療,早晚各1袋,治療12周。對照組予以等量安慰劑(糊精和矯味劑)治療,兩組療程一致。上述配方顆粒全部由華潤三九藥業有限公司統一制作。

1.6 觀察指標及方法

1.6.1 療效指標 分別在入組當天、治療第12周末對研究對象進行缺血性中風證候要素量表評分和 NIHSS評分。①中醫療效評價：根據治療前后氣虛、血瘀證候積分變化,對兩組差異進行統計分析。②西醫療效評價：根據治療前后NIHSS評分變化,參照1995年全國第四次腦血管病學術會議制定的臨床療效評定標準[8]進行評定,基本痊愈：NIHSS評分減少90%～100%;顯著進步：NIHSS評分減少46%～89%;進步：NIHSS評分減少18%～45%;無效：NIHSS評分減少或增加<18%;惡化：神經功能缺損評分增加>18%。

1.6.2 安全性指標 包括體溫、脈搏、呼吸、血壓等生命體征,血、尿常規,肝腎功能,心電圖,并詳細記錄研究中出現的任何不良反應。

1.6.3 血清代謝組學檢測 將50 μL血清樣本加入含有內標(甲醇∶乙腈=1∶1)的沉淀劑450 μL中,渦旋混勻60 s;以4 ℃,13 000 r/min離心10 min后吸取上清液100 μL,置于Thermo Q EXACTIVE液質聯用系統中準備進行液相色譜串聯質譜(LC-MS/MS)分析。儀器名稱：DIONEX Ultimate 3000超高效液相色譜儀。色譜柱：ACQUITY BEH C18 1.7 μm,2.1 mm×50 mm。液相條件：水(含2 mmoL/L甲酸銨和0.1%甲酸),乙腈;梯度洗脫,分析時間0～18 min,進樣量5 μL,流速0.25 mL/min。洗脫梯度程序：0～1 min,5%乙腈;1～5 min,5%乙腈;5～8 min,60%乙腈;8～11 min,100%乙腈;11～14 min,100%乙腈;14～15 min,60%乙腈;15～18 min,5%乙腈。樣品質譜信號采集分別采用電噴霧電離(ESI)正負離子掃描模式,參數為噴霧電壓3 000 V;蒸發溫度350 ℃;鞘氣35 Arb;輔助氣10 Arb;毛細管溫度320 ℃;S-lens RF50。監測模式：一級全掃描(Full scan),二級數據依賴性掃描(Full MS/dd-MS2)。參數：一級全掃描(Full scan)：分辨率：70 000;AGC target：1e6;Maximun TT：100 ms;掃描范圍：質荷比(m/z)70～1 050。二級數據依賴性掃描(Full MS/dd-MS2)：分辨率：35 000;AGC target：1e5;Maximun TT：50 ms;碰撞能量(NCE)：20 eV、40 eV、60 eV。

血清代謝組學資料應用中國檢驗檢疫科學研究院自建的Tracefounder軟件對LC-MS/MS數據進行預處理,獲得變量保留時間_質荷比(rt_mz)、分子量(comPMW)、觀察量(樣本)和峰強。將編輯后的數據矩陣導入MetaboAnalyst 4.0軟件進行主成分分析(PCA)。變量投影重要性(variable importance in projection,VIP)反映每個變量對模型解釋的貢獻度,定義當代謝物的VIP值>1.0時,認為對模型有顯著貢獻。利用MetaboAnalyst 4.0軟件分析VIP>1.0的主要差異代謝物,選擇P>0.1作為影響的主要代謝通路。

2 結 果

2.1 NIHSS評分 與治療前比較,兩組治療后NIHSS評分均降低(P<0.05);治療后,兩組NIHSS評分比較,差異無統計學意義(Z=-0.671,P=0.561)。詳見表1。

表1 兩組治療前后NIHSS評分比較 單位：分

2.2 中醫證候評分 與治療前比較,兩組治療后氣虛及血瘀評分均顯著降低(P<0.01);治療后,治療組較對照組氣虛評分更低(P<0.05),兩組治療后血瘀評分比較,差異無統計學意義(P=0.774)。詳見表2、表3。

表2 兩組治療前后氣虛評分比較(±s) 單位：分

表3 兩組治療前后血瘀評分比較(±s) 單位：分

2.3 臨床療效 根據兩組治療前后NIHSS評分變化評價標準比較兩組臨床療效,結果顯示,兩組均無惡化病人,治療組總有效率高于對照組,但差異無統計學意義(P>0.05)。詳見表4。

表4 兩組臨床療效比較

2.4 腦梗死恢復期氣虛血瘀證與健康對照組血清代謝組學比較

2.4.1 PCA PCA可明顯區分健康者和腦梗死恢復期氣虛血瘀證病人(干預前)的血清代謝組整體差異,詳見圖1。

圖1 不同性別腦梗死恢復期氣虛血瘀證病人與健康人PCA得分圖(A為男性,粉色表示腦梗死恢復期氣虛血瘀證男性病人,綠色表示健康男性;B為女性,綠色表示腦梗死恢復期氣虛血瘀證女性病人,粉色表示健康女性)

2.4.2 差異分層聚類分析 不同性別組間差異血清代謝組聚類分析見圖2。圖中水平軸和垂直軸分別代表樣本與變量信息;顏色深淺反映變量值大小,紅色表示含量升高,綠色表示含量降低,顏色越深表明變化量越大。

圖2 不同性別腦梗死恢復期氣虛血瘀證病人與健康人血清代謝組差異分層聚類熱圖(A為男性,紅色表示腦梗死恢復期氣虛血瘀證男性病人,綠色表示健康男性;B為女性,綠色表示腦梗死恢復期氣虛血瘀證女性病人,紅色表示健康女性)

2.4.3 代謝產物差異變化 基于VIP>1.0和ANOVA過濾P<0.05,篩選出健康受試者與腦梗死恢復期氣虛血瘀證受試者的差異代謝產物。

男性：共發現46個差異代謝產物,與健康人(J)相比,腦梗死恢復期氣虛血瘀證病人(A)有34個代謝物質的血清含量水平上升,12個代謝物質水平下降;水平上升的代謝物質有磷脂酰膽堿(PC)(16：1(9Z)/22：5(7Z,10Z,13Z,16Z,19Z))、PC(18：0/20：4(8Z,11Z,14Z,17Z))、PC(16：1(9Z)/20：3(8Z,11Z,14Z))、PC(18：2(9Z,12Z)/P-18：1(9Z))、PC(16：1(9Z)/22：2(13Z,16Z))、PC(o-18：1(9Z)/20：4(8Z,11Z,14Z,17Z))、PC(14：0/22：5(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z))、PC(18：3(6Z,9Z,12Z)/16：0)、PC(18：1(9Z)/20：4(5Z,8Z,11Z,14Z))、PC(o-16：1(9Z)/18：2(9Z,12Z))、PC(20：3(5Z,8Z,11Z)/20：3(5Z,8Z,11Z))、PC(o-18：0/22：6(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z))、PC(o-16：1(9Z)/18：0)、鞘磷脂(SM)(d18：1/22：0)、SM(d18：0/24：1(15Z))、SM(d18：1/24：0)、SM(d18：1/22：1(13Z))、SM(d17：1/24：0)、SM(d16：1/24：1(15Z))、SM(d18：0/22：0)、SM(d18：1/20：0)、溶血磷脂酰膽堿(LysoPC)(18：1(11Z))、LysoPC(20：4(8Z,11Z,14Z,17Z))、LysoPC(16：1(9Z))、LysoPC(17：0)、乳酸、L-纈氨酸、植物鞘氨醇、L-脯氨酸、L-亮氨酸、油酸、D-葡萄糖、L-乙酰肉堿、肌醇;水平下降的代謝物質有全賴氨酸、組胺、硬脂酸、煙酰胺、棕櫚酸、瓜氨酸、脫氫表雄酮、3-羥基-3-甲基-2-氧代丁酸、維生素C、PC(O-16：0/18：2(9Z,12Z))、3-氨基丁酸、丙酰肉堿。詳見表5。

女性：共發現51個差異性代謝產物,與健康人(J)相比,腦梗死恢復期氣虛血瘀證病人(X)有33個代謝物質的血清含量水平上升,18個代謝物質水平下降。水平上升的代謝物質有PC(18：0/20：4(8Z,11Z,14Z,17Z))、PC(14：0/22：5(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z))、PC(20：3(5Z,8Z,11Z)/20：3(5Z,8Z,11Z))、PC(16：1(9Z)/22：2(13Z,16Z))、PC(14：0/18：1(9Z))、PC(18：1(9Z)/20：4(5Z,8Z,11Z,14Z))、SM(d18：0/18：1(11Z))、SM(d18：1/14：0)、SM(d18：1/18：0)、SM(d18：1/18：1(11Z))、SM(d18：0/18：0)、LysoPC(20：4(8Z,11Z,14Z,17Z))、油酸、L-乙酰肉堿、亞油酸、瓜氨酸、棕櫚酸、花生四烯酸、2-羥基丁酸、二十二碳六烯酸、十六烷酮、癸酰肉堿、煙酰胺、組胺、L-纈氨酸、二十二碳五烯酸、9-癸酰膽堿、L-辛烷基肉堿、N-(3-氧代碘癸酰基)-L-高絲氨酸內脂、3-羥基-3-甲基-2-氧代丁酸、硬脂酸、亞油酰肉堿、丙烯酰肉堿;水平下降的代謝物質有PC(18：2(9Z,12Z)/P-18：1(9Z))、PC(O-16：1(9Z)/18：2(9Z,12Z))、PC(O-18：1(9Z)/20：4(8Z,11Z,14Z,17Z))、PC(O-18：1(9Z)/18：2(9Z,12Z))、PC(O-18：0/18：2(9Z,12Z))、PC(O-18：0/22：6(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z))、SM(d18：1/22：0)、SM(d18：0/24：1(15Z))、SM(d18：1/22：1(13Z))、SM(d16：1/24：1(15Z))、SM(d18：1/24：0)、溶血磷脂酰乙醇胺(LysoPE)(0：0/18：2(9Z,12Z))、LysoPE(0：0/18：1(9Z))、左旋肉堿、脫氫表雄酮、鵝去氧膽酸甘氨酸偶聯物、肌酸、景天庚酮糖。詳見表6。

綜合不同性別的組間差異血清代謝產物,腦梗死恢復期氣虛血瘀證病人與健康人相比,男性和女性血清代謝產物共同升高的有PC(18：0/20：4(8Z,11Z,14Z,17Z))、PC(16：1(9Z)/22：2(13Z,16Z))、PC(14：0/22：5(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z))、PC(18：1(9Z)/20：4(5Z,8Z,11Z,14Z))、PC(20：3(5Z,8Z,11Z)/20：3(5Z,8Z,11Z))、油酸、L-乙酰肉堿、L-纈氨酸,下降的有脫氫表雄酮。

表5 男性內源性物質變化(VIP>1.0)

表6 女性內源性物質變化(VIP>1.0)

2.4.4 涉及的代謝通路 利用MetaboAnalyst 4.0軟件分析VIP>1.0的具有差異的內源性代謝產物,選擇P>0.1為影響代謝物質改變的主要代謝通路。男性腦梗死恢復期氣虛血瘀證病人代謝物質改變涉及的代謝通路有6條,分別是淀粉與蔗糖代謝、精氨酸生物合成、煙酸和煙酰胺代謝、組氨酸代謝、磷酸肌醇代謝、甘油磷脂代謝,詳見表7。女性腦梗死恢復期氣虛血瘀證病人代謝物質改變涉及的代謝通路有6條,分別是亞油酸代謝、花生四烯酸代謝、精氨酸生物合成、煙酸和煙酰胺代謝,組氨酸代謝和甘油磷脂代謝,詳見表8。通路分析見圖3。橫坐標Pathway Impact代表通路的重要性值,縱坐標-log(P)代表代謝通路分析的顯著性水平;代謝通路的Pathway Impact和-log(P)值越大,圓圈越大,代表代謝差異的相關性越強。

表7 男性代謝通路分析結果

表8 女性代謝通路分析結果

圖3 不同性別腦梗死恢復期氣虛血瘀證病人的重要代謝通路分析圖(A為男性;B為女性)

2.5 補陽還五湯治療腦梗死恢復期氣虛血瘀證的血清代謝組學效應

2.5.1 PCA PCA得分圖見圖4。

圖4 補陽還五湯治療腦梗死恢復期氣虛血瘀證前后的PCA得分圖(A為男性;B為女性。X1、X2分別代表治療前后治療組病人,J代表健康受試者)

2.5.2 差異分層聚類分析 治療組不同性別用藥前后血清代謝組聚類分析見圖5。圖中水平軸和垂直軸分別代表樣本與變量信息。顏色深淺反映變量值大小,紅色表示含量升高,藍色表示含量降低,顏色越深表明變化量越大。

圖5 治療組用藥前后差異分層聚類分析熱圖(A為男性;B為女性。X1、X2分別代表治療前后治療組病人,J代表健康受試者)

2.5.3 代謝產物差異變化 經過ANOVA過濾,篩選出VIP>1.0和P<0.05的代謝物。

男性：共發現39個差異代謝產物,與治療前相比,治療后有32個代謝物質的血清含量水平上升,7個代謝物質水平下降。水平上升的代謝物質有PC(18：0/20：4(8Z,11Z,14Z,17Z))、PC(16：1(9Z)/22：5(7Z,10Z,13Z,16Z,19Z))、PC(16：1(9Z)/22：2(13Z,16Z))、PC(18：1(9Z)/20：4(5Z,8Z,11Z,14Z))、PC(18：3(6Z,9Z,12Z)/16：0)、PC(o-18：1(9Z)/20：4(8Z,11Z,14Z,17Z))、PC(o-16：1(9Z)/18：0)、PC(14：0/22：1(13Z))、乳酸、SM(d18：1/22：0)、SM(d18：0/24：1(15Z))、SM(d18：1/24：0)、SM(d18：1/22：1(13Z))、SM(d17：1/24：0)、SM(d16：1/24：1(15Z))、SM(d18：1/20：0)、SM(d18：0/22：0)、LysoPC(20：4(8Z,11Z,14Z,17Z))、LysoPC(20：3(5Z,8Z,11Z))、LysoPC(17：0)、LysoPC(P-18：0)、LysoPC(20：2(11Z,14Z))、L-纈氨酸、油酸、煙酰胺、亞油酸、花生四烯酸、L-脯氨酸、L-乙酰肉堿、L-色氨酸、2-羥基丁酸、3-氨基丁酸;下降的物質有瓜氨酸、組胺、3-羥基-3-甲基-2-氧代丁酸、棕櫚酸、PC(14：0/22：5(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z))、PC(o-16：1(9Z)/18：2(9Z,12Z))、丙酰肉堿。詳見表9。

女性：共發現37個差異代謝產物,與治療前相比,治療后有27個代謝物質的血清含量水平上升,10個代謝物質水平下降。水平上升的代謝物質有PC(18：0/20：4(8Z,11Z,14Z,17Z))、PC(18：1(9Z)/20：4(5Z,8Z,11Z,14Z))、PC(o-16：1(9Z)/18：2(9Z,12Z))、PC(18：2(9Z,12Z)/P-18：1(9Z))、PC(14：0/22：0)、SM(d18：0/18：1(11Z))、SM(d18：1/14：0)、SM(d18：1/18：0)、SM(d18：1/18：1(11Z))、SM(d18：0/18：0)、SM(d18：1/16：0)、LysoPC(20：3(5Z,8Z,11Z))、亞油酸、花生四烯酸、癸酰肉堿、脫氫異雄酮硫酸鹽、L-辛酰肉堿、9-癸酰肉堿、反式-2-十二烯酰肉堿、順式-5-十四烯酰肉堿、16-二氫鞘氨醇、二十二碳五烯酸、4-羥基脯氨酸、3,5-十四碳二烯碳鳥嘌呤、十二烷酰肉堿、D-葡萄糖、全賴氨酸;下降的物質有油酸、L-乙酰肉堿、LysoPC(20：4(8Z,11Z,14Z,17Z))、PC(14：0/22：5(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z))、左旋肉堿、鵝去氧膽酸甘氨酸偶聯物、LysoPE(0：0/18：1(9Z))、2-羥基丁酸、二十二碳六烯酸、棕櫚酸。詳見表10。

綜合不同性別的差異血清代謝產物,經補陽還五湯治療后,腦梗死恢復期氣虛血瘀證男性和女性受試者共同升高的血清代謝產物有PC(18：0/20：4(8Z,11Z,14Z,17Z))、PC(14：0/22：1(13Z))、PC(18：1(9Z)/20：4(5Z,8Z,11Z,14Z))、PC(o-16：1)、PC(o-18：1)、SM(d18：1)、SM(d18：0)、LysoPC(20：3(5Z,8Z,11Z))、亞油酸、花生四烯酸,下降的物質有棕櫚酸。

表9 治療組男性病人治療前后代謝物質變化

2.5.4 涉及的代謝通路 治療組男性治療前后代謝物質變化涉及的重要代謝通路有7條,分別是亞油酸代謝、花生四烯酸代謝、精氨酸生物合成、鞘磷脂代謝、組氨酸代謝、色氨酸代謝和甘油磷脂代謝。詳見表11。治療組女性治療前后代謝物質變化涉及的重要代謝通路有5條,分別是亞油酸代謝、淀粉和蔗糖代謝、花生四烯酸代謝、鞘磷脂代謝和甘油磷脂代謝。詳見表12。重要通路分析圖見圖6。橫坐標Pathway Impact代表的是通路的重要性值,縱坐標-log(P)代表代謝通路分析的顯著性水平;代謝通路的Pathway Impact和-log(P)值越大,圓圈越大,代表代謝差異的相關性越高。

表11 治療組男性病人治療前后涉及的代謝通路

表12 治療組女性病人治療前后涉及的代謝通路

圖6 治療組不同性別病人治療后涉及的重要代謝通路分析圖(A為男性;B為女性)

2.6 安全性指標 治療過程中,兩組血、尿常規,肝腎功能及心電圖檢查均未見明顯異常,且均未發現與服藥有關的不良反應。

3 討 論

補陽還五湯出自清代醫家王清任的《醫林改錯》,是治療中風病氣虛血瘀證的經典方劑。本研究結果表明,補陽還五湯治療腦梗死恢復期方面宏觀療效確切,尤其在改善氣虛證候方面較安慰劑療效更顯著。為進一步探索機制,研究采用LC-MS/MS的分析方法,篩選出與腦梗死恢復期氣虛血瘀證相關及應用補陽還五湯治療前后的病人血清代謝產物,發現變化主要與能量代謝、磷脂代謝、脂肪酸代謝和氨基酸代謝過程有關。同時研究通過對比不同性別受試者的代謝物質變化情況,發現某些代謝物質在不同性別中表現出不同的變化趨勢,可能與性別密切相關,但相關證據缺乏,尚待進一步研究。本研究提示的重要代謝途徑多數集中在磷脂代謝、氨基酸代謝、脂肪酸代謝、類固醇類激素代謝等方面,與機體的能量合成、血管內皮炎性損傷反應、動脈粥樣硬化形成、神經元修復等過程密切相關。

3.1 磷脂代謝 磷脂主要包括PC、LysoPC、SM、磷脂酰乙醇胺(PE)和LysoPE,這些分子構成細胞膜的主要成分,在調節膜酶活性、膽固醇穩態和信號通路等方面發揮著重要的作用[9]。PC、LysoPC和SM占到了血清磷脂的95%以上,均含有膽堿,是血清中的3種主要磷脂。其中,PC占細胞總磷脂的40%～50%,對脂蛋白膜的結構和功能發揮著重要的作用[10]。磷脂在細胞生長增殖,維持機體新陳代謝,增強機體免疫力等方面發揮著重要作用[11]。某些磷脂可作為心腦血管疾病、癌癥、糖尿病、腎病等疾病的潛在標志物。LysoPC是PC經過內皮脂肪酶激活后產生的,具有參與細胞生長和分化的特定受體[12-13],與炎癥、動脈粥樣硬化、2型糖尿病和肥胖等有關[14]。體外研究和動物模型表明,LysoPC既有促動脈粥樣硬化的生物活性,同時也具有抗動脈粥樣硬化的生物活性[15-16],不同LysoPC生物活性由酰鏈長度和飽和度決定,不同種類的LysoPC作用尚未完全揭示。SM是神經酰胺與PC或PE結合后形成的一種磷脂,在神經細胞軸突周圍的髓鞘中含量豐富,約18%的血漿磷脂均以SM的形式存在,已證實導致動脈粥樣硬化的低密度脂蛋白膽固醇和極低密度脂蛋白膽固醇中均富含SM。體內SM水平與動脈粥樣硬化密切相關,有研究顯示,動脈粥樣硬化病人體內總的SM含量高于無動脈粥樣硬化人群[17]。本研究顯示,腦梗死恢復期受試者血清中的多種PC、SM、LysoPC較正常人呈升高趨勢,少數PC、SM水平下降,表明病人體內存在磷脂代謝改變,發病后發生磷脂代謝變化,可能與動脈粥樣硬化導致腦梗死的病理機制相關。

3.2 氨基酸代謝 纈氨酸是一種必需氨基酸,存在于人體中的為L-纈氨酸,Chen等[18]研究顯示,L-纈氨酸可增強巨噬細胞的吞噬功能,具有抗感染的潛力,影響炎癥的發生與轉歸。倪宇昕等[19]研究顯示,L-纈氨酸可促進巨噬細胞炎性因子的表達。本研究顯示腦梗死恢復期受試者血清L-纈氨酸較對照組升高,提示腦梗死恢復期病人機體存在炎癥,可能與血管炎性改變密切相關,提示急性腦血管事件的機體炎癥狀態可持續長達數周至數月,從代謝組學角度闡釋了腦梗死恢復期的炎癥病理持續過程。

3.3 脂肪酸代謝 油酸是一種單不飽和脂肪酸,是游離脂肪酸的主要成分。正常情況下,游離脂肪酸是三大能源物質代謝過程中的重要組成部分。肝糖原耗盡時,脂肪組織將中性脂肪分解為游離脂肪酸充當能源使用,亦可引起體內游離脂肪酸增加。油酸可保護大腦免受缺血性損傷,油酸在大腦缺血性損傷后積聚可能是對缺血性腦損傷的保護性反應,腦梗死恢復期病人血清油酸水平升高可反映大腦中油酸含量的增加,提示其對損傷大腦的保護作用,但具體機制尚未明確。同時,大量的油酸有助于促進游離脂肪酸的生成,為機體供能提供更多的底物。

棕櫚酸是一類常見的飽和脂肪酸,是人體內含量最多的游離脂肪酸,含量過多易引起膽固醇升高、血管內皮損傷、動脈硬化,并導致心腦血管疾病。腦梗死的病理基礎為腦組織缺血缺氧壞死,組織缺氧條件下可誘導異常增殖細胞中缺氧誘導因子-1α激活,并抑制棕櫚酸的代謝分解,從而導致其大量積累[20],使脂肪酸β氧化障礙,影響了體內能量代謝。補陽還五湯治療后,血清棕櫚酸水平下降,表明補陽還五湯可能通過改善體內缺氧狀況促進腦缺血后因低氧導致的棕櫚酸β氧化,調節脂肪酸代謝,從而改善體內能量代謝,促進腦梗死恢復期病人的康復。

肉堿可與長鏈脂肪酸結合形成酰肉堿,從而使長鏈脂肪酸以酰肉堿形式通過線粒體膜進入線粒體,參與脂肪酸β氧化產生能量[21],是脂肪酸供能的必要物質。血清肉堿(游離肉堿和酰肉堿)可反映機體總肉堿水平,有助于判斷機體是否存在脂肪酸氧化障礙和能量代謝異常。L-乙酰肉堿是左旋肉堿的一種活化形式,在大腦、肌肉和精子中含量豐富,能通過血腦屏障,傳遞脂肪酸進入線粒體,完成脂肪酸β氧化過程,生成三磷酸腺苷(ATP)供能協助能量轉移。本研究結果表明,腦梗死恢復期氣虛血瘀證病人血清L-乙酰肉堿較健康受試者均有所增加,提示腦梗死恢復期病人體內可能出現了脂肪酸代謝障礙引起能量代謝異常,從而導致肉堿水平代償性升高。與臨床表現出的氣虛癥狀相對應,提示中醫的“氣虛”狀態與機體能量代謝障礙具有潛在的相關性。

3.4 類固醇激素 脫氫表雄酮(DHEA)是一種雄激素,對腦缺血模型具有神經保護作用。已有研究表明,腦卒中急性期出現的認知障礙與體內DHEA濃度下降密切相關[22]。脫氫異雄酮硫酸鹽(DHEAS)是DHEA的硫酸化代謝物,DHEA和DHEAS水平下降與神經元功能障礙和變性有關,可能是由于這些類固醇激素可保護中樞神經系統神經元免受有害物質的傷害。另有研究表明,血清DHEA水平與神經系統疾病嚴重程度呈負相關[23]。本研究結果顯示,腦梗死恢復期氣虛血瘀證病人血清DHEA水平低于健康人,提示DHEA保護缺血后損傷的神經元的作用有限,易引起腦梗死恢復期病人認知功能的下降,對預測疾病相關的認知能力下降可能具有一定作用。

綜上所述,補陽還五湯可一定程度調節腦梗死恢復期氣虛血瘀證病人物質代謝水平,降低血清部分飽和脂肪酸(棕櫚酸)水平,提高部分不飽和脂肪酸(亞油酸、花生四烯酸)水平,改善部分磷脂代謝(磷脂酰膽堿類、鞘磷脂類)水平,從而發揮抗動脈粥樣硬化,保護缺血后受損的神經細胞,改善機體能量代謝,從而促進神經功能恢復的潛在作用。除去目前已知的可被藥物影響的磷脂、油酸等代謝物質,本研究結果顯示,腦梗死恢復期病人血清L-乙酰肉堿、L-纈氨酸水平升高及DHEA水平降低,因此可能具有作為疾病標志物的潛力,為相關藥物的研發提供了新思路。然而,腦缺血后的物質代謝變化復雜,本研究僅初步探索了腦梗死恢復期氣虛血瘀證病人的血清代謝組學特征,并初步提示了補陽還五湯干預后的人體代謝水平變化及不同性別間代謝物質變化的復雜性,藥物如何通過影響差異代謝物質對疾病發揮治療作用需進一步探索和驗證,今后可進一步擴大樣本量,結合血、唾液、尿、便等多重生物學樣本進行多組學聯合的研究,利用靶向組學和生物示蹤技術,期待進一步揭示中醫經典方劑治療本病的作用機制。