RegⅢγ修飾HuMSCs對柯薩奇B3病毒誘導的心肌炎炎性細胞浸潤及心臟功能的影響

蹇 強,李 丹,程 瑋,孫 敏

心肌炎是心臟炎癥性疾病,也是擴張型心肌病的前兆,通常以細胞浸潤為主要特征,若心肌炎癥在急性期未消退,心臟可能由于心肌細胞壞死受到直接損害,肉芽腫性炎癥引起的損傷或成纖維細胞的增殖和膠原沉積引起的纖維化,可能導致擴張型心肌病或充血性心力衰竭發生[1-2]。心肌炎病因包括感染性和非感染性,其中病毒感染是心肌炎的常見病因,病毒可能在遺傳易感個體中誘發心肌炎,兒童更易患心肌炎,目前,引起病毒性心肌炎的病毒主要包括柯薩奇病毒B、人類免疫缺陷病毒1、流感病毒及甲型和丙型肝炎病毒等[3]。盡管在較多研究中應用了包括皮質類固醇在內的免疫抑制藥物治療病毒性心肌炎,但效果存在爭議。

近年來,越來越多的實驗和臨床研究為應用細胞移植改善心肌功能的策略提供支持。間充質干細胞(mesenchymal stem cells,MSCs)具有抗凋亡、抗纖維化和促血管生成等作用。人臍帶間充質干細胞(human mesenchymal stem cells,HuMSCs)是從臍帶動脈和靜脈及內皮下、血管周圍區域中分離出來的細胞,較其他干細胞的來源豐富,生物學性狀穩定,具有低免疫原性等特點[4-5]。已有研究表明,HuMSCs移植可能通過調節內質網應激、細胞外信號調節激酶(ERK)1/2信號傳導途徑和抑制心肌細胞凋亡減輕急性心肌炎大鼠的心肌損傷和心臟功能障礙[6]。胰島再生源蛋白Ⅲγ(islet regenerating Ⅲγ,RegⅢγ)是一種免疫炎癥調節因子,在多種疾病或受損組織中表達,通過促進細胞增殖和抵抗細胞凋亡,發揮修復組織損傷的功能[7]。本研究通過慢病毒介導RegⅢγ感染HuMSCs,得到RegⅢγ修飾的HuMSCs,觀察其對柯薩奇B3病毒(CVB3)誘導的心肌炎小鼠模型心臟功能及損傷的影響,以期為臨床治療提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康無特定病原體(SPF)級雄性BALB/C小鼠40只,4周齡,由西安交通大學實驗動物中心提供,飼養于無特定病原體屏障環境,溫度為22～24 ℃,相對濕度為(50±5)%,12 h/12 h明暗周期交替。本研究獲得我院倫理委員會審批。

1.2 實驗試劑 RegⅢγ重組表達載體(PCDH-CMV-GFP-RegⅢγ)的構建、轉染細胞及慢病毒包裝過程均由上海捷瑞生物工程有限公司完成。胎牛血清(杭州四季青),DMEM/F12培養液和胰蛋白酶(美國HyClone公司),Trizol試劑盒(美國Thermo公司),Sensi Fast c-DNA 合成試劑盒和SensiFast SYBR Green Hi-ROX試劑盒(英國Bioline公司),酶聯免疫吸附測定(ELISA)試劑盒(江蘇凱基生物技術股份有限公司),蘇木精-伊紅(HE)染色試劑盒(北京中杉金橋生物技術有限公司),免疫組織化學染色試劑盒(上海翊圣生物科技有限公司),抗體CD34、CD44、CD45、CD73、CD90、人類白細胞抗原-DR蛋白(HLA-DR)、CD4、CD8及CD68(英國Abcam公司),辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔或山羊抗小鼠(武漢博士德生物工程有限公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 HuMSCs的提取、培養及鑒定 收集我院婦產科無菌健康新生兒的臍帶組織,磷酸緩沖鹽溶液(PBS)洗滌干凈,剪成約1 mm3的組織塊,加入膠原酶Ⅱ消化,篩網過濾,濾液以4 000 r/min離心10 min,棄上清,加入含10%胎牛血清的DMEM/F12培養液,置于37 ℃、體積分數5%CO2的恒溫箱培養,3～5 d后換液,棄未貼壁細胞,繼續培養,每隔2 d換液1次。倒置顯微鏡觀察細胞,融合度達80%后胰酶消化,擴大培養。選擇第3代細胞,流式細胞儀檢測細胞表面抗原CD34、CD44、CD45、CD73、CD90及HLA-DR的表達。

1.3.2 慢病毒感染HuMSCs 將HuMSCs消化后,按照每孔5×104個細胞的密度接種于24孔板,放于37 ℃、體積分數5%CO2的恒溫箱內,待生長至融合度達到80%時,在培養孔內加入含有過表達RegⅢγ的慢病毒懸液的培養液,混勻后,置于細胞培養箱,根據細胞生長狀態,12～16 h更換培養液,感染24 h和48 h后,在熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白表達情況。

1.3.3 實時熒光定量聚合酶鏈式反應(qRT-PCR)實驗 在感染后的HuMSCs中加入Trizol試劑液,按說明步驟提取總RNA,經分光光度計檢測純度與濃度后,根據Sensi Fast c-DNA合成試劑盒將總RNA逆轉錄合成cDNA。以獲得的cDNA為模板,經過Rotor GeneQ熒光定量PCR儀進行擴增,檢測RegⅢγ mRNA的表達水平,具體操作按照SensiFast SYBR Green Hi-ROX試劑盒說明書進行,以β-actin作為內參基因。擴增條件：95 ℃ 2 min,95 ℃ 5 s,60 ℃ 10 s,共40個循環。RegⅢγ和GAPDH引物由上海生工生物工程有限公司合成,引物序列：RegⅢγ正向引物5′-AAGGTTGATTCTTTCAGGGAGC-3′,反向引物5′-AGTGGATCTGAGTTAGGTCATGG-3′;β-actin正向引物5′-TGCGTGACATGAGAAG-3′,反向引物5′-GCTCGTAGCTTCTCCA-3′。使用2-ΔΔCt法計算目的基因表達量。

1.3.4 動物建模與分組處理 將40只小鼠按照隨機數字表法分為對照組、模型組、HuMSCs組和RegⅢγ-HuMSCs組,每組10只。模型組、HuMSCs組和RegⅢγ-HuMSCs組均采用腹腔內注射200 μL含102半數組織培養感染劑量的CVB3病毒液建立心肌炎模型[8],對照組注射等量生理鹽水。次日,HuMSCs組和RegⅢγ-HuMSCs組小鼠分別尾靜脈注射100 μL的HuMSCs、RegⅢγ-HuMSCs,注射細胞數量均為1×106個,對照組和模型組小鼠均尾靜脈注射100 μL的生理鹽水。

1.3.5 心臟超聲檢查 14 d后,采用異氟烷麻醉4組小鼠,固定在手術臺上,應用高分辨率小動物超聲成像系統,采集并記錄小鼠超聲相關指標射血分數(ejection fraction,EF)、縮短分數(fractional shortening,FS)、左室舒張末期容積(end-diastolic volume,LVEDV)和左室收縮末期容積(left ventricular end-systolic volume,LVESV),通過系統軟件進行處理數據。

1.3.6 ELISA實驗 心臟超聲檢查完畢后,4組小鼠摘眼球取血,血液室溫靜置1h后,4℃條件下,以4 000 r/min離心10 min,取血清,根據試劑盒說明書操作,ELISA法檢測各組血清白細胞介素(IL)-2、IL-4、IL-6、IL-10和IL-23含量。

1.3.7 HE染色 處死4組小鼠,解剖取其心肌組織,清洗干凈后,采用4%多聚甲醛室溫固定過夜。次日,梯度乙醇對心肌組織進行脫水,二甲苯透明,蠟塊包埋,制作厚度約為4 μm的石蠟切片,采用HE染色對心肌組織石蠟切片進行染色,切片進行脫蠟水化后,加入蘇木素染色5 min,流水沖洗干凈,再用伊紅染液復染3 min,脫水、透明后,中性樹膠封片,光學顯微鏡下攝影并觀察組織形態學結構變化情況。

1.3.8 末端脫氧核苷酸轉移酶介導的dUTP缺口末端標記測定法(TUNEL)染色 取制備的小鼠心肌組織石蠟切片,脫蠟水化后,將蛋白酶K與緩沖液混合進行稀釋,使用100 μL的蛋白酶K工作液(20 μg/mL),37 ℃條件下孵育10 min,PBS漂洗干凈,封閉液處理10 min,50 μL TUNEL試劑液孵育1 h。3,3′-二氨基聯苯胺(DAB)顯色,蘇木素復染,脫水、透明后,中性樹膠封片,光學顯微鏡下攝影并觀察,隨機選擇5個視野,陽性染色為棕褐色,代表凋亡細胞,計數視野下陽性細胞與總細胞,以兩者比值作為TUNEL陽性率。

1.3.9 免疫組織化學染色 將制備的4組小鼠石蠟切片進行常規脫蠟水化,置于檸檬酸鹽液浸泡,進行高溫修復抗原。3%過氧化氫溶液孵育10 min后,將切片用5%山羊血清室溫封閉30 min。加入一抗T淋巴細胞表面抗原(CD4、CD8)和巨噬細胞特異性抗體(CD68)工作液,放于4 ℃下孵育過夜。次日,棄去一抗液,加入對應二抗工作液,室溫繼續孵育60 min。利用DAB法染色,蘇木精復染5 min,分化數秒,自來水沖洗干凈,脫水、透明后,中性樹膠封片,光學顯微鏡下對免疫組織化學切片攝影,陽性染色呈棕色至棕褐色,應用Image Pro Plus 6.0軟件測定陽性染色區域的平均吸光度值。

2 結 果

2.1 HuMSCs的鑒定結果 倒置顯微鏡下觀察分離培養的細胞,第7天可見細胞較少,且聚集成團;第14天細胞明顯增多,形狀為典型的紡錘形。流式細胞術檢測結果顯示,細胞表面抗原CD44、CD73和CD90表達水平均較高,CD34、CD45及HLA-DR表達均較低。詳見圖1。說明成功分離到HuMSCs。

2.2 慢病毒感染HuMSCs效果測定 轉染24 h、48 h后,倒置熒光顯微鏡觀察到經過慢病毒感染的HuMSCs中均可見綠色熒光蛋白表達,48 h時表達明顯,感染率達到98.4%。qRT-PCR檢測結果顯示,感染含RegⅢγ的RegⅢγ-HuMSCs組細胞中RegⅢγ mRNA表達水平高于未感染的對照組細胞(P<0.05)。詳見圖2。此結果說明已獲得RegⅢγ修飾的HuMSCs。

2.3 RegⅢγ修飾HuMSCs對心肌炎小鼠心功能的影響 與對照組比較,模型組小鼠EF、FS降低,LVEDV、LVESV升高(P<0.05);與模型組比較,HuMSCs組和RegⅢγ-HuMSCs組EF、FS均升高,LVEDV、LVESV均降低(P<0.05);與HuMSCs組比較,RegⅢγ-HuMSCs組EF和FS均升高,LVEDV和LVESV均降低(P<0.05)。詳見圖3、表1。

圖1 HuMSCs鑒定(A為倒置顯微鏡觀察HuMSCs形態;B為流式細胞術檢測HuMSCs表面抗原表達)

與HuMSCs組比較,＊P<0.05。圖2 HuMSCs感染(A為倒置熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白表達;B為qRT-PCR檢測細胞RegⅢγ mRNA表達水平)

圖3 各組小鼠心臟超聲圖像

表1 各組小鼠心功能指標EF、FS、LVEDV及LVESV比較(±s)

2.4 RegⅢγ修飾HuMSCs對心肌炎小鼠血清炎性因子水平的影響 ELISA檢測結果顯示,與對照組比較,模型組小鼠血清IL-2、IL-6和IL-23含量增加,IL-4和IL-10含量減少(P<0.05);與模型組比較,HuMSCs組和RegⅢγ-HuMSCs組血清IL-2、IL-6和IL-23含量減少,IL-4和IL-10含量增加(P<0.05);與HuMSCs組比較,RegⅢγ-HuMSCs組血清IL-2、IL-6和IL-23含量減少,IL-4和IL-10含量增加(P<0.05)。詳見表2。

表2 各組小鼠血清炎性因子水平比較(±s) 單位：pg/mL

2.5 RegⅢγ修飾HuMSCs對心肌炎小鼠心肌組織病理損傷的影響 HE染色結果顯示,對照組小鼠心肌組織內細胞形態規則,排列整齊,無炎性細胞浸潤;模型組心肌組織內細胞排列紊亂,炎性細胞浸潤明顯,有壞死灶,且有部分血管滲出蛋白黏液;HuMSCs組心肌組織仍有炎性細胞浸潤,但病理損傷較模型組減輕;RegⅢγ-HuMSCs組心肌組織內細胞排列較為整齊,結構清晰,未見明顯炎性細胞浸潤現象。詳見圖4。

圖4 HE染色檢測各組小鼠心肌組織病理損傷(200 μm)

2.6 RegⅢγ修飾HuMSCs對心肌炎小鼠心肌細胞凋亡的影響 TUNEL染色結果顯示,對照組小鼠心肌組織內棕褐色細胞染色減少;相較于對照組,模型組小鼠心肌組織內有大量棕褐色細胞,TUNEL陽性率高于對照組(P<0.05);與模型組比較,HuMSCs組和RegⅢγ-HuMSCs組心肌組織棕褐色細胞減少,TUNEL陽性率降低(P<0.05);RegⅢγ-HuMSCs組TUNEL陽性率低于HuMSCs組(P<0.05)。詳見圖5、圖6。

圖5 TUNEL染色檢測各組小鼠心肌細胞凋亡(50 μm)

模型組與對照組比較,＊P<0.05;與模型組比較,#P<0.05;RegⅢγ-HuMSCs組與HuMSCs組比較,△P<0.05。圖6 TUNEL染色檢測各組小鼠心肌細胞凋亡比較

2.7 RegⅢγ修飾HuMSCs對心肌炎小鼠心肌組織CD4、CD8、CD68表達的影響 免疫組織化學染色結果顯示,模型組小鼠心肌組織內CD4、CD8及CD68蛋白均呈強陽性表達,可見明顯的棕褐色染色,CD4、CD8、CD68蛋白表達均高于對照組(P<0.05);HuMSCs組和RegⅢγ-HuMSCs組心肌組織內棕褐色染色強度較模型組減少,CD4、CD8及CD68蛋白表達降低(P<0.05);RegⅢγ-HuMSCs組CD4、CD8及CD68蛋白表達較HuMSCs組下降(P<0.05)。詳見圖7、圖8。

圖7 免疫組織化學染色檢測心肌組織CD4、CD8、CD68表達(200 μm)

模型組與對照組比較,＊P<0.05;與模型組比較,#P<0.05;RegⅢγ-HuMSCs組與HuMSCs組比較,△P<0.05。圖8 免疫組織化學染色檢測心肌組織CD4、CD8、CD68表達比較

3 討 論

心肌炎是炎性細胞浸潤到心肌組織,導致心臟功能惡化的風險增加,且臨床表現具有異質性。心肌炎主要由病毒感染介導,也可由細菌、原生動物或真菌感染、多種有毒物質和藥物及全身免疫介導的疾病所誘發。盡管目前進行了廣泛研究,但并發左心室功能障礙、心力衰竭或心律失常的心肌炎,常出現危及生命的癥狀,包括惡性心律失常、心源性休克及猝死等[2,9]。由于心肌炎臨床表現具有多樣性和病因復雜性,需結合具體情況制定治療方案,即對癥支持治療,在此基礎上,包括主動脈內球囊反搏、體外膜肺氧合及心室輔助裝置等在內的器械支持也是常用的治療方法[10]。近年來,免疫抑制和抗病毒治療在心肌炎的研究中得以運用,但這些方法的療效均不理想。減輕心肌炎的炎癥反應和抑制心肌細胞凋亡對提高心臟功能具有積極的意義。

HuMSCs除了具有自我更新能力外,同時表現出較小的免疫排斥反應,可用于同種異體移植,這些特征表明HUMSCs治療自身免疫性疾病及修復組織損傷的潛力,并已得到證實。HUMSCs通過芳烴受體(AhR)調節宿主免疫和腸道微生物群之間的相互作用,在類風濕性關節炎大鼠中發揮治療作用[11];HuMSCs調節通過轉化生長因子β1/Smad家族成員3(TGF-β1/Smad3)信號途徑參與抑制卵巢組織的纖維化,修復原發性卵巢功能不全大鼠的卵巢功能[12];鼻腔移植細胞球蛋白(CYGB)修飾HuMSCs后,通過蛋白38型絲裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)途徑介導細胞凋亡改善新生大鼠缺氧缺血性腦損傷[13]。本研究超聲心動圖分析結果表明,經過CVB3誘導的小鼠EF和FS降低,LVEDV和LVESV升高,表明心肌收縮和舒張功能受損;CVB3誘導的小鼠中尾靜脈注射HuMSCs后,EF、FS均升高,LVEDV、LVESV均降低。經過HuMSCs治療后的小鼠心肌組織病理損傷減輕,炎性細胞浸潤減少,心肌細胞凋亡受到抑制。由此說明,HuMSCs可抑制心肌炎小鼠炎癥反應和心肌細胞凋亡,可改善心臟功能損傷。

Reg屬于C類凝集素超家族,具有多種生物調節功能,如參與細胞增殖、凋亡、炎癥反應及抗菌作用等。RegⅢγ作為該家族的成員,可對損傷組織起到修復作用。有研究表明,RegⅢγ可促進培養的結腸上皮細胞生長,并在成年小鼠的小腸中高表達,在葡聚糖硫酸鈉誘導的結腸炎中發揮組織保護作用[14]。嚴重聯合免疫缺陷小鼠中,腸道共生菌可活化RegⅢγ基因表達,由此推測其參與大腸炎發生中的先天免疫[15]。RegⅢγ可加快急性肝衰竭中的肝再生[16]。本研究結果顯示,經過RegⅢγ修飾的HuMSCs治療心肌炎小鼠后,相較于HuMSCs治療比較,該作用引起EF和FS進一步升高,LVEDV和LVESV進一步降低,心肌組織病理損傷顯著改善,組織結構清晰,且心肌細胞凋亡減少。這一結果表明,RegⅢγ修飾可促進HuMSCs對心肌炎小鼠心功能及心肌組織損傷的改善作用。

由于心肌炎的常見原因是病毒感染、細菌感染及自身免疫性疾病,且心肌炎中常觀察到淋巴細胞和單核細胞浸潤,并檢測到促炎趨化因子、細胞因子等表達增加[17-18],因此,炎癥反應是心肌炎主要病癥之一,抑制炎性因子和炎性細胞浸潤對改善心肌炎十分重要。本研究結果顯示,在CVB3誘導的小鼠血清促炎因子IL-2、IL-6和IL-23含量均增加,抑炎因子IL-4和IL-10含量均減少,心肌組織內T淋巴細胞表面抗原CD4、CD8和巨噬細胞特異性抗體CD68表達增強,說明機體內發生炎癥反應,心肌組織內炎性細胞浸潤,以淋巴細胞和巨噬細胞為主。進一步通過尾靜脈注射HuMSCs和RegⅢγ-HuMSCs治療后,血清IL-2、IL-6和IL-23含量均減少,IL-4和IL-10含量均增加,心肌組織內CD4、CD8和CD68表達減弱。由此推測,RegⅢγ修飾的HuMSCs具有保護心肌炎小鼠心臟的作用,可能與抑制心肌炎性遞質浸潤有關。

綜上所述,經RegⅢγ修飾可促進HuMSCs對CVB3誘導的小鼠病毒性心肌炎發揮心臟功能的保護作用,抑制血清炎癥反應和組織內炎性細胞浸潤,減少心肌組織細胞凋亡,為心肌炎的研究提供了新方向和理論支持,然而具體機制有待進一步闡明。