TMAO通過PI3K/Akt/mTOR通路干預急性心肌梗死病人動脈斑塊的作用機制

邵良發,鄢高亮,張啟杰,楊宏飛

動脈粥樣硬化性疾病包括急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)是發展中國家死亡和致殘的主要原因[1]。除了動脈粥樣硬化斑塊大小外,斑塊穩定性也是AMI的主要危險因素[2]。因此,尋找有效的方法提高頸動脈粥樣硬化斑塊穩定性是十分必要的。有研究表明,血漿三甲胺-N-氧化物(trimethylamine-N-oxide,TMAO)水平在動脈粥樣硬化病人中升高,且與動脈粥樣硬化加速有關[3]。有研究報道,載脂蛋白E基因敲除(ApoE-/-)小鼠中采用TMAO的斑塊總面積增加了2倍[4]。上述研究提示降低TMAO水平可能是預防動脈粥樣硬化進展的有效方法。然而,TMAO在動脈粥樣硬化斑塊穩定性中的作用及機制尚未明確。本研究通過光學相干斷層掃描(optical coherence tomography,OCT)評估ST段抬高性心肌梗死(ST-segment elevation myocardial infarction,STEMI)病人的斑塊形態,分析血漿TMAO水平與OCT檢測到的易損斑塊之間的關系,同時探討了觸發TMAO形成的黃素單加氧酶3抑制劑甲巰咪唑(methimazole,MMI)對動脈粥樣硬化家兔模型斑塊穩定性的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2019年3月—2021年2月205例接受OCT評估罪犯病變的STEMI病人。納入標準：STEMI病人;年齡≥18歲;病人簽署書面知情同意書。205例病人中,49例被排除,其中支架內血栓形成14例,大量血栓8例,圖像質量差20例和其他病因7例。將156例病人分為易損組(54例)和非易損組(102例)。STEMI定義為持續性胸痛>30 min,ST段抬高>0.1 mV,至少兩個相鄰導聯或18導聯心電圖(ECG)出現新的左束支傳導阻滯,肌鈣蛋白I水平升高。罪犯病變由心臟病專家和影像技術人員通過心電圖、超聲心動圖、血管造影和OCT進行鑒定。

1.2 OCT圖像分析 OCT圖像由2名研究員在St Jude OCT離線審查工作站中分析,出現不一致結果時采用共同協商解決。易損和非易損斑塊的觀察者內Kappa系數分別為0.962和0.951,觀察者間Kappa系數為0.813。根據相關標準[5],非易損斑塊是通過破壞的纖維帽和清晰的空腔形成。易損斑塊定義為罪犯病變處的斑塊至少有一個不同光信號強度的異質信號豐富層位于管腔表面附近,并與下面的組織清楚區分,詳見圖1。圖中白色箭頭表示血栓。

圖1 典型OCT圖像

1.3 測定血漿TMAO水平 肝素化前,通過橈骨或股骨通路采集血樣,收集于含有乙二胺四乙酸(EDTA)的真空采集試管。樣品置于-80 ℃環境中,進一步分析。采用穩定同位素稀釋液相色譜-串聯質譜法定量血漿TMAO水平。

1.4 實驗動物及分組 將我院實驗動物中心提供的24只無特定病原體(SPF)級新西蘭雄性大白兔(8周齡)隨機分為正常組(對照組)、動脈粥樣硬化組(模型組)和動脈粥樣硬化+MMI治療組(干預組),每組8只家兔。對照組飼喂標準兔飼料,模型組和干預組飼喂高膽固醇高脂飼料(1%膽固醇、4%豬油、15%蛋黃粉)。喂養第13周,干預組家兔給予MMI灌胃給藥(批號：HY-B0208,美國MedChemExpress公司),劑量為15 mg/kg,每日1次,連續給藥4周。模型組家兔注射等量生理鹽水。飼養過程中,每4周記錄一次家兔體質量和血漿TMAO水平。第16周結束,所有家兔全身注射肝素抗凝,之后采用戊巴比妥鈉處死。取出主動脈組織進行病理分析。

1.5 組織學分析 將主動脈組織置于4%多聚甲醛中固定24 h,蔗糖脫水后包埋于最佳切割溫度(OCT)復合物中,連續冰凍切片厚7 μm。將冰凍切片用油紅O(美國Sigma)、蘇木精-伊紅(HE)(美國Sigma)和Masson三色染色(北京Solarbio公司)染色觀察斑塊病變。選擇覆蓋壞死核心的連續纖維帽切片,繪制垂直于管腔的線測量纖維帽厚度。每個斑塊隨機選擇3個位置測量纖維帽厚度和內膜-中層厚度,取平均值。內膜/中層比值為內膜面積(內部彈性層面積減去管腔面積)與中層面積(內部和外部彈性層之間的面積)比值。為了對主動脈區域的總粥樣硬化斑塊進行正面分析,每個主動脈沿著縱軸展開,之后固定在黑色背景板上。主動脈采用油紅O染色,并使用高分辨率相機拍攝。

1.6 免疫印跡法(Western Blot)分析 模型組和干預組取斑塊顯著的組織進行檢查。將100 mg組織加入1 mL RIPA裂解緩沖液中進行組織均質化以提取總組織蛋白。將等量的蛋白質加載到十二烷基酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)凝膠上進行分離,并將分離的蛋白質轉移到0.45 μm聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上(美國Millipore公司)。使用5%脫脂奶粉封閉后,在膜上依次加入相應的一級抗體和二級抗體。本實驗使用以下抗體：抗雷帕霉素靶蛋白(mTOR,1∶500,美國Santa Cruz公司),抗磷酸化mTOR(p-mTOR)(1∶500,Santa Cruz),抗磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K,1∶1 000,美國Proteintech公司),抗磷酸化PI3K(p-PI3K)(1∶1 000,Proteintech),蛋白激酶B(Akt,1∶1 000,Proteintech),抗磷酸化Akt(p-Akt)(1∶1 000,Proteintech)和抗GAPDH(1∶2 000,Santa Cruz)。二級抗體為辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗小鼠IgG(美國Servicebio公司)。使用化學發光試劑顯示條帶,Bio-Rad成像儀曝光和掃描。利用Quantity-One軟件對免疫反應條帶進行定量分析,并以GAPDH作為內參測定靶蛋白相對表達量。

2 結 果

2.1 病人臨床資料 納入病人的平均年齡57歲,男性占81.4%,高血壓病人占55.1%,糖尿病病人占30.1%。易損組較非易損組年齡更大,體質指數更低,易損組斑塊破裂和薄纖維帽粥樣硬化斑塊發生率高于非易損組(P<0.01)。易損組血漿TMAO水平高于非易損組(P<0.001),且纖維帽厚度降低(P<0.001)。相關性分析結果顯示,TMAO與纖維帽厚度呈負相關(r=-0.418,P<0.001),詳見圖2。

表1 易損組和非易損組臨床資料比較

(續表)

圖2 TMAO和纖維帽厚度的相關性散點圖

2.2 家兔的基本特征及血漿TMAO水平變化 實驗過程中,對照組家兔一般情況良好,模型組和干預組家兔表現出食欲差、無精打采、毛發稀疏、行動遲緩等輕微癥狀。3組體質量繼續穩定增長。高脂飼料喂養8～12周,模型組和干預組體質量增加均大于對照組,12周時差異顯著,詳見圖3A。與對照組比較,4周時、8周時、12周時和16周時模型組血漿TMAO水平升高(P<0.05);16周時干預組血漿TMAO水平低于模型組(P<0.001)。詳見圖3B。

模型組與對照組比較,＊P<0.05,＊＊P<0.01,＊＊＊P<0.001;干預組與模型組比較,#P<0.001。圖3 各組家兔體質量和血漿TMAO水平變化(A為各組體質量折線圖;B為各組血漿TMAO水平變化)

2.3 主動脈粥樣硬化及斑塊易損性情況 為進一步定量比較動脈粥樣硬化病變,對3組家兔的主動脈進行病理染色分析。與對照組比較,模型組主動脈出現更多的紅色脂質斑塊,干預組顯著降低了脂質斑塊的比例,詳見圖4A。HE染色顯示：對照組主動脈血管形態正常,模型組動脈管腔明顯變窄,動脈內膜增厚,內膜下可見大量泡沫細胞和炎性細胞,中層平滑肌細胞排列紊亂,詳見圖4B。Masson染色顯示：模型組主動脈粥樣硬化斑塊表面覆蓋著弱纖維帽,甚至部分斷裂;對照組主動脈內彈力膜連續和完整,但模型組中由于大量脂質侵入而嚴重受損,并在動脈粥樣硬化斑塊下破裂成碎片;干預組可減少脂質浸潤,改善內膜完整性,詳見圖4C。干預組可減輕主動脈內膜增生,降低內膜-中層厚度和內膜/中層比值,同時增加斑塊纖維帽厚度,詳見圖4D～圖4F。

與模型組比較,＊P<0.01。圖4 各組主動脈粥樣硬化斑塊組織學特征和病理變化(A為動脈粥樣硬化斑塊主動脈胸腹段縱剖面的油紅O染色圖;B為主動脈HE染色圖;C為主動脈Masson染色圖;D為模型組與干預組動脈粥樣硬化斑塊纖維帽厚度比較的柱狀圖;E為模型組與干預組內膜-中層厚度比較的柱狀圖;F為模型組與干預組內膜/中層比值比較的柱狀圖)

2.4 MMI對動脈粥樣硬化斑塊中PI3K/Akt/mTOR信號分子蛋白表達的影響 模型組動脈粥樣硬化斑塊p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt和p-mTOR/mTOR蛋白表達高于對照組(P<0.001);干預組動脈粥樣硬化斑塊p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt和p-mTOR/mTOR蛋白表達低于模型組(P<0.05或P<0.01)。詳見圖5。

模型組與對照組比較,＊P<0.001;干預組與模型組比較,#P<0.05,##P<0.01。圖5 MMI對動脈粥樣硬化斑塊中PI3K/Akt/mTOR信號分子蛋白表達的影響(A為PI3K/Akt/mTOR信號分子蛋白條帶圖;B為PI3K/Akt/mTOR信號分子蛋白柱狀圖)

3 討 論

易損斑塊的形成通過將冠狀動脈管腔逐漸狹窄缺血促進動脈粥樣硬化斑塊發展[6]。一項病理研究表明,復發性斑塊破裂或侵蝕后愈合可能促進斑塊生長和增加負擔[7]。與非易損斑塊的病人比較,罪犯部位易損斑塊的病人管腔狹窄程度更高,病變更長、更復雜[8]。本研究納入的34.6%STEMI病人罪犯斑塊中發現了易損斑塊,且易損斑塊病人存在較多的斑塊破裂和薄纖維帽粥樣硬化斑塊,增加了心血管事件風險。本研究結果顯示,易損斑塊病人血漿TMAO水平高于非易損斑塊病人;相關性分析顯示,TMAO與纖維帽厚度呈負相關。TMAO是膳食中膽堿和磷脂酰膽堿依賴腸道微生物群的副產物,來源于黃素單加氧酶3對三甲胺的氧化[9]。含三甲胺的營養素廣泛存在于日常生活食物中,包括紅肉、蛋黃和海鮮。TMAO可增強血小板反應性,減少膽固醇逆向轉運,增加巨噬細胞泡沫細胞活化,并與冠狀動脈疾病的進展和預后密切相關[10]。因此,TMAO可能參與STEMI病人罪犯病變斑塊破裂。

為了進一步評估TMAO在斑塊穩定性中的作用,采用新西蘭家兔模擬動脈粥樣硬化,由于家兔與人類病理學之間有較強的相似性;家兔對高膽固醇飲食敏感,高膽固醇飲食可導致顯著的主動脈粥樣硬化表型[11]。本研究結果顯示,與對照組比較,模型組主動脈出現更多的紅色脂質斑塊,動脈管腔變窄,動脈內膜增厚,并在內膜下可見大量泡沫細胞和炎性細胞,中層平滑肌細胞排列紊亂。Masson染色顯示,模型組主動脈粥樣硬化斑塊表面覆蓋著弱纖維帽,甚至部分斷裂。這些發現提示新西蘭家兔成功模擬了動脈粥樣硬化斑塊易損模型。同時結果顯示,模型組各時間血漿TMAO水平高于對照組;采用MMI降低血漿TMAO水平有助于減輕家兔主動脈粥樣硬化模型主動脈內膜增生,降低內膜-中層厚度和內膜/中層比值,同時增加斑塊纖維帽厚度。結果表明,降低血漿TMAO水平減輕了高脂喂養引起的兔動脈粥樣硬化的發展,并一定程度降低了動脈粥樣硬化斑塊不穩定性。

目前,PI3K/Akt/mTOR通路認為是調節動脈粥樣硬化斑塊形成的關鍵通路,多項研究表明,抑制PI3K/Akt/mTOR通路能有效改善動脈粥樣硬化[12-13]。有研究顯示,miR-126通過抑制PI3K/Akt/mTOR通路恢復自噬通量,減輕低密度脂蛋白誘導的人臍靜脈內皮細胞損傷[13]。相關研究顯示,PI3K/Akt/mTOR通路是血管生成的關鍵通路,其下游血管內皮生長因子和基質金屬蛋白酶細胞因子通過誘導血管生成,促進動脈粥樣硬化斑塊進展[14-15]。本研究結果顯示,模型組動脈粥樣硬化斑塊中p-PI3K、p-Akt和p-mTOR表達顯著高于對照組,表明PI3K/Akt/mTOR信號通路在動脈粥樣硬化斑塊形成過程中被激活。采用MMI處理后這些蛋白水平均降低,提示TMAO可能通過PI3K/Akt/mTOR信號通路參與斑塊形成。

綜上所述,TMAO在AMI病人罪犯病變斑塊破裂中發揮著重要作用。STEMI病人和兔動脈粥樣硬化模型血漿TMAO水平增加,可能通過激活PI3K/Akt/mTOR通路促進動脈粥樣硬化進展和斑塊易損,抑制血漿TMAO水平可能是預防AMI的一種新策略。