梔子提取物對局灶性腦缺血損傷模型大鼠凝血功能及腦血管內(nèi)皮功能的影響

王碰治,侯志婷,黃家福,林毅勝

腦缺血主要指腦血液供應不足,難以供應腦組織正常的生理代謝,進而發(fā)生一系列癥狀的綜合征[1]。腦缺血為常見的中老年人疾病,長期嚴重威脅人類健康,近年來該病發(fā)病率呈年輕化趨勢,是我國目前重點防治的疾病之一[2]。腦缺血主要危害腦組織的健康,輕微局灶性腦缺血無明顯癥狀,嚴重的局灶性腦缺血引起凝血及纖溶系統(tǒng)異常,造成血管內(nèi)皮細胞受損,進一步破壞抗凝、抗血栓作用,進而導致神經(jīng)功能等多種功能性障礙,因此,凝血功能及腦血管內(nèi)皮功能是判斷局灶性腦缺血的重要指標[3]。目前局灶性腦缺血以藥物治療為主,但手段單一,造成治療效果不完善,近年來采用中草藥配合預防腦血管疾病,應用于臨床治療的研究逐漸增多,已成為研究的熱點[4]。

梔子屬茜草科植物,作為中國藥典收錄品種,在我國民間有悠久的用藥歷史[5]。現(xiàn)代研究表明,梔子提取物(gardenia extract,GE)主要含有梔子苷類、西紅花苷類、梔子素類等化學成分,具有多種藥理活性,可促進血液循環(huán),防治動脈粥樣硬化和腦出血等[6]。盡管GE的藥理活性已被廣泛證實,但其對腦缺血組織的作用機制尚未明確。GE是否參與調(diào)節(jié)腦血管內(nèi)皮活性、促進生物凝血功能,進而改善腦組織缺血損傷的機制尚未明確[7-8]。本研究以局灶性腦缺血損傷模型大鼠為研究對象,觀察GE對凝血功能及腦血管內(nèi)皮功能的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑與儀器 GE為實驗室采集新鮮干燥的梔子制備(UPLC測定有效成分梔子苷含量>60%,西紅花苷>10%),一氧化氮(nitric oxide,NO)、內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS)酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測試劑盒(貨號：ER0148)購自武漢菲恩生物科技有限公司,大鼠血管壁血栓素A2(vascular wall thromboxane A2,TXA2)ELISA檢測試劑盒(貨號：BH-R101190)購自上海博湖生物科技有限公司,凝血酶活性熒光檢測試劑盒(貨號：AS-72130)購自AnaSpec公司,內(nèi)皮組織纖維溶酶原激活物(tissue plasminogen activator,t-PAT)ELISA檢測試劑盒(貨號：ZK-R3361)購自深圳子科生物科技有限公司,纖維溶酶原激活物抑制劑(plasminogen activator inhibitor,PAI)ELISA檢測試劑盒(貨號：ml003024)和大鼠血漿前列環(huán)素I2(prostaglandin I2,PGI2)ELISA檢測試劑盒(貨號：TW3899)購自上海通蔚生物科技有限公司,酶聯(lián)免疫檢測儀(DG5033A,南京華東電子集團醫(yī)療裝備有限責任公司)。

1.2 動物模型的構(gòu)建 清潔級SD大鼠48只[購自天津醫(yī)科大學腫瘤醫(yī)院,許可證號SYXK(津)2017-0005],隨機分為假手術(shù)組(sham組)、模型組(model組)、GE高劑量組(GE-H組)、GE低劑量組(GE-L組),每組12只。所有大鼠麻醉處理,sham組大鼠頸部切開,分離左側(cè)總動脈、頸內(nèi)動脈、頸外動脈,保留完整血管,縫合各層皮下組織和肌肉,消毒處理。分離model組、GE-H組、GE-L組大鼠左側(cè)總動脈、頸內(nèi)動脈、頸外動脈后,使用電熱燒灼器燒掉頸外動脈分支,分離頸外動脈主干段,結(jié)扎處理。剪開一個小口,插入尼龍線栓子,插入深度為20 mm,阻斷供血1 h后恢復大腦血流,縫合各層皮下組織和肌肉,消毒處理。待動物蘇醒,參照Longa神經(jīng)學評分標準進行評分,0分：正常,無神經(jīng)功能缺損;1分：右側(cè)前爪無法完全舒展,輕度神經(jīng)功能缺損;2分：行走時,大鼠朝右側(cè)轉(zhuǎn)圈,中度神經(jīng)功能缺損;3分：行走時,大鼠身體朝右側(cè)傾倒,重度神經(jīng)功能缺損;4分：不能自主行走,喪失部分意識。GE-L組和GE-H組分別在大鼠腦缺血處理后每日腹腔注射10 mg/mL、100 mg/mL的GE 1 mL,連續(xù)注射2周;sham組和model組腹腔注射等量生理鹽水。2周后再采用Longa神經(jīng)學評分標準評定model組、GE-H組、GE-L組大鼠神經(jīng)功能恢復情況。

1.3 凝血功能及腦血管內(nèi)皮功能指標 凝血功能指標：藥物注射治療2周后,剪斷大鼠尾部末端,迅速收集300 μL血液,采用凝血酶活性熒光檢測試劑檢測凝血酶時間(thrombin time,TT)、凝血酶含量及凝血因子Ⅹa含量;將鼠尾靜脈血滴到載玻片上,每隔10 s使用大頭針由外側(cè)向內(nèi)側(cè)輕挑,直至出現(xiàn)纖維蛋白絲為止,記錄用時即為凝血時間(coagulation time,CT)。同時使用濾紙每隔10 s吸附尾尖溢出血液,直至出血停止,記錄用時即為出血時間(bleeding time,BT)。血管內(nèi)皮功能指標：凝血功能指標檢測后,斷頭處死大鼠,分離取出大腦動脈環(huán)(Willis),按照ELISA檢測試劑盒方法檢測Willis動脈環(huán)NO、eNOS及血漿PGI2含量和內(nèi)皮組織t-PAT、TXA2及PAI活性。

1.4 腦組織病理學變化 處死大鼠后迅速開顱,解剖獲取腦組織,分離腦缺血區(qū)組織,使用4%多聚甲醛固定24 h,乙醇梯度脫水,包埋劑處理后切片,蘇木精染色3 min,清水沖洗2 min,低濃度鹽酸乙醇分化處理,清水沖洗直至返藍,0.5%伊紅染色3 min,清水沖洗2 min,乙醇梯度脫水,二甲苯染色透明,中性樹脂封片,置于顯微鏡下觀察病理學變化。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠凝血功能指標比較 與sham組比較,model組CT、BT、TT縮短,凝血酶生成及內(nèi)源性、外源性凝血因子Ⅹa生成升高(P<0.05);與model組比較,GE-H組和GE-L組CT、BT、TT延長,凝血酶生成及內(nèi)源性/外源性凝血因子Ⅹa生成降低(P<0.05)。詳見表1。

表1 各組大鼠凝血功能指標比較(±s)

2.2 各組大鼠腦血管內(nèi)皮功能指標比較 與sham組比較,model組t-PAT、PGI2、NO、eNOS降低,PAI、TXA2升高(P<0.05);與model組比較,GE-H組和GE-L組t-PAT、PGI2、NO、eNOS升高,PAI、TXA2降低(P<0.05)。詳見表2。

表2 各組大鼠腦血管內(nèi)皮功能指標比較(±s)

2.3 各組大鼠治療前后Longa神經(jīng)學評分比較 與sham組比較,model組治療前后Longa神經(jīng)學評分升高;sham組和model組治療前后Longa神經(jīng)學評分比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);與治療前比較,GE-H組和GE-L組治療后Longa神經(jīng)學評分降低,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);與model組治療后比較,GE-H組和GE-L組治療后Longa神經(jīng)學評分降低(P<0.05)。詳見表3。

表3 各組Longa神經(jīng)學評分比較(±s) 單位：分

2.4 局灶性腦缺血損傷模型大鼠腦組織病理變化 sham組大鼠腦組織結(jié)構(gòu)完整,未出現(xiàn)壞死灶及腦出血組織,神經(jīng)細胞排列緊密,無明顯的細胞核融合現(xiàn)象;model組大鼠腦組織出現(xiàn)壞死灶,發(fā)生局部腦出血組織,腦出血組織內(nèi)神經(jīng)細胞排列松散,細胞核融合;GE-H組和GE-L組未見壞死灶,少量神經(jīng)細胞排列紊亂,無明顯的細胞核融合現(xiàn)象;GE-H組腦組織損傷情況及細胞核融合現(xiàn)象較model組明顯好轉(zhuǎn),且優(yōu)于GE-L組。詳見圖1。

圖1 各組腦組織病理學變化(×200)

3 討 論

腦缺血癥狀復雜多樣,常造成病人多方面功能衰弱甚至缺失,使病人出現(xiàn)凝血功能異常,嚴重時導致內(nèi)皮細胞破損,內(nèi)皮功能異常[9]。GE具有多種藥理活性,其中主要的有效成分梔子苷證實具有促進內(nèi)皮細胞增殖和修復的作用[10],但其作用機制和作用途徑尚未明確。本研究通過檢測凝血功能和腦血管內(nèi)皮功能指標,結(jié)合HE染色觀察,觀察GE對局灶性腦缺血大鼠功能的影響。

凝血過程主要分為凝血酶的生成、酶原的激活及纖維蛋白的形成[11]。為了觀察凝血功能的變化,本研究通過檢測BT、CT得到凝血過程中的基礎數(shù)據(jù),判斷各組間凝血用時的差異。凝血酶將血漿中的可溶性纖維蛋白轉(zhuǎn)換為不溶性纖維蛋白,從而快速凝血,故采用TT反映纖維蛋白的形成過程,判斷纖維蛋白形成時間[12]。凝血因子Ⅹ在出血時被凝血酶原激活為凝血因子Ⅹa,與血小板共同參與凝血,修復損傷[13],因此使用凝血酶含量及凝血因子Ⅹa含量判斷凝血酶生成量及凝血酶原激活情況。本研究結(jié)果顯示,腦缺血損傷處理后大鼠CT、BT、TT縮短,凝血酶和凝血因子Ⅹa生成升高,提示腦缺血損傷過程中凝血作用異常增強;GE處理后,CT、BT、TT延長,凝血酶和凝血因子Ⅹa含量降低,表明GE使局灶性腦缺血損傷大鼠體內(nèi)產(chǎn)生了明顯的抗凝血效應,改善了體內(nèi)的凝血功能。

NO是生物體內(nèi)重要的舒張血管因子,在內(nèi)皮血管中分泌,參與調(diào)節(jié)血管舒張程度,對血栓形成、動脈粥樣硬化等具有抑制作用,而eNOS直接催化NO活性,兩者可作為判斷腦血管內(nèi)皮功能的重要指標[14]。PAI是一種纖溶酶原激活抑制物,濃度過高時抑制纖溶系統(tǒng)活性,是形成血栓、破壞內(nèi)皮細胞功能的主要因子之一[15]。PGI2和t-PAT均由內(nèi)皮細胞合成和釋放,其中PGI2與TXA2維持動態(tài)平衡,平衡失調(diào)直接導致血栓及內(nèi)皮損傷[16],而t-PAT可促進纖維蛋白的溶解,降解纖維蛋白原和凝血因子,降低凝血作用[17]。本研究將t-PAT活性的增強、PAI表達下降及PGI2高表達作為判斷腦血管內(nèi)皮功能正常的重要指標,同時t-PAT也可作為判斷凝血功能的重要指標。本研究結(jié)果顯示,腦缺血損傷處理后t-PAT、PGI2、NO、eNOS降低,PAI、TXA2升高,表明腦缺血損傷處理導致腦血管內(nèi)皮功能嚴重受損;GE處理后,t-PAT、PGI2、NO、eNOS升高,PAI、TXA2降低,表明GE可修復局灶性腦缺血損傷大鼠腦血管內(nèi)皮功能,使腦血管內(nèi)皮功能逐漸恢復正常。t-PAT含量變化進一步證實了GE對局灶性腦缺血損傷大鼠凝血功能的改善作用。經(jīng)GE處理后,HE染色結(jié)果證實,大鼠腦組織損傷情況減輕,且Longa神經(jīng)學評分結(jié)果表明,大鼠神經(jīng)功能得到改善,說明GE通過改善凝血功能和內(nèi)皮功能可減輕局灶性腦缺血損傷大鼠的腦組織損傷并提高神經(jīng)功能。

綜上所述,GE作用后,可延長CT、BT、TT,降低凝血酶和凝血因子含量,發(fā)揮明顯的抗凝血作用;增強NO、eNOS活性,舒張血管,提高t-PAT、PGI2表達同時抑制PAI、TXA2的表達,改善血管內(nèi)皮功能,調(diào)節(jié)纖溶功能,進而改善局灶性腦缺血損傷大鼠腦組織病變情況,恢復神經(jīng)功能。GE在治療腦血管疾病中具有很大的潛力,而GE能否通過其他作用途徑間接參與調(diào)控凝血功能及腦血管內(nèi)皮功能,進而恢復神經(jīng)功能,或通過改善缺血腦組織其他功能緩解腦組織受損,需要在今后的研究中進一步深入挖掘和探討。