擴張型心肌病病人CD247基因多態性與遺傳易感的關系

李超民,李淵博,董曉華,徐林杰,韓 勇,羅 薇

目前,關于擴張型心肌病(dilated cardiomyopathy,DCM)的發病機制仍在不斷研究中,遺傳因素和非遺傳因素均是其發生的原因[1]。有研究顯示,自身免疫是參與DCM心力衰竭發展和進展的關鍵機制[2]。T細胞在DCM發病機制中發揮著雙重作用,一方面,T細胞可幫助B細胞產生自身抗體;另一方面,它們釋放細胞因子以誘導纖維化[3]。全基因組分析顯示了DCM與T細胞分化、增殖和激活相關基因的關聯[4]。T細胞受體T3 zeta 鏈(CD3ζ),也稱為CD247,對T細胞受體-CD3(TCR/CD3)復合物的組裝、表面表達和信號級聯重要[5],該途徑異常導致T細胞功能障礙和自身免疫性疾病發展[5]。相關研究已證實,CD247與多種自身免疫性疾病之間存在關聯,包括系統性紅斑狼瘡、類風濕性關節炎等[6]。然而,CD247基因突變是否與DCM的易感性相關報道較少。本研究假設是CD247通過自身免疫的病理過程介導不良的心臟重塑,探討了已證實與自身免疫疾病相關的3個CD247單核苷酸多態性(single-nucleotide polymorphisms,SNP)rs1052237[7]、rs2056626[8]和rs864537[9]是否與DCM的易感性相關。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選取2015年3月—2019年4月在我院連續招募同意參與基因研究的279例DCM病人作為病例組。DCM入選標準：根據歐洲心臟病學會(ESC)工作組關于的DCM臨床診斷[10];排除標準：非DCM、冠心病、原發性瓣膜性心臟病、先天性心臟病、肺源性心臟病、心包炎、腫瘤或免疫系統疾病。臨床評估、實驗室檢查、超聲心動圖和冠狀動脈造影(或冠狀動脈計算機斷層造影)及心臟磁共振成像和心臟放射性核素檢查(如有臨床指征)進行診斷評估。所有病人的電子病歷均包括家族史。對照組為同期于我院進行體檢的健康者363名,通過問卷調查、體檢、血清生化指標和超聲心動圖評估,均為身體健康;排除標準：心血管疾病史或癥狀、服用任何心血管疾病藥物及糖尿病診斷。測定超聲心動圖參數,包括左室射血分數(LVEF)和心臟內部尺寸。

1.2 SNP基因分型 采集血液至含有乙二胺四乙酸(EDTA)的容器中。根據標準鹽析法從外周靜脈血的白細胞中提取基因組DNA,在iPLEX SNP基因分型分析儀(美國Sequenom公司)上使用Sequenom-MassARRAY系統進行SNP基因分型。聚合酶鏈式反應(PCR)和相關延伸反應的所有分析均由在線分析設計套件軟件(Sequenom)設計,引物由美國Invitrogen公司合成。根據Sequenom MassARRAY SNP技術提供的標準方法,進行PCR條件、等位基因特異性引物延伸及其產物分析。使用MassARRAY Typer 4.0軟件(Sequenom)對產生的質譜進行處理和分析,測定峰識別和等位基因。為了確保獲得的基因型是有效的,在5%的DNA樣本中對各個SNP進行重復的基因型分析,所有結果完全一致,對所有其他數據進行盲法基因分型。基因分型調用率為99.0%～99.5%。

1.3 隨訪 第3個月、第6個月、第1年通過訪問、電話或醫療記錄進行隨訪。記錄之后每年生存狀況和死亡病因,預后評估包括全因死亡或心血管疾病死亡。

1.4 統計學處理 采用SPSS 19.0統計軟件進行分析。采用雙尾獨立t檢驗比較病例組和對照組之間連續變量的差異。采用Kruskal-Wallish檢驗比較3種遺傳模式下基因型間非正態連續變量的差異。分類變量的比較采用χ2檢驗。通過χ2擬合優度檢驗評估對照組中每個SNP與Hardy-Weinberg平衡(HWE)的偏差。χ2檢驗評估病例組和對照組等位基因和基因型頻率的差異。采用Logistic回歸分析不同遺傳模式或等位基因指定的基因型對DCM易感性的影響。Kaplan-Meier圖和多變量Cox回歸分析用于根據基因型定義的亞組的生存分析。顯著性閾值設定為P<0.05。錯誤發現率(FDR)控制用于調整多次測試。

2 結 果

2.1 兩組臨床資料比較(見表1)

表1 兩組臨床資料比較

2.2 兩組CD247基因型分布 DCM病人中,rs1052237的G等位基因和rs2056626的C等位基因頻率較低(P<0.05),詳見表2。加性模型中,rs1052237和rs2056626與DCM的低易感性相關(P值分別為0.045,0.040),并在隱性遺傳模型中傾向于降低DCM的易感性(P值分別為0.052,0.064)。詳見表3。

表2 兩組CD247基因多態性等位基因頻率比較 單位：例(%)

表3 兩組CD247基因型分布 單位：例

2.3 CD247基因多態性與DCM病人血清CD247水平、臨床指標的關聯 在加性模型和顯性模型下,rs864537的A變異體與DCM病人的血清CD247水平較低相關(P值分別為0.032,0.012)。rs1052237的G變異體與DCM病人血清CD247低水平相關(加性模型,P=0.020;顯性模型,P=0.020;隱性模型,P=0.037)。詳見表4。rs864537的AA基因型與較低的LVEF(隱性模型,P=0.018;加性模型,P=0.039),較高的左室舒張末期內徑(加性模型,P=0.033)有關。詳見表5。

表4 DCM病人CD247基因多態性與血清CD247水平的關系(n=279)

表5 DCM 病人CD247基因多態性與心功能指標的關系

2.4 CD247基因多態性對DCM病人預后的影響 所有DCM病人隨訪時間為(20.6±10.6)個月,其中60例死于其他原因,57例死于心血管疾病。Kaplan-Meier和多變量Cox回歸分析表明,CD247基因的3個SNP多態性對DCM病人的全因死亡或心血管死亡無影響。詳見表6。

表6 CD247基因多態性對DCM病人預后的影響

3 討 論

DCM是一種病因未明的自身免疫性疾病,有證據支持遺傳因素在DCM易感性和進展中發揮著重要作用[11]。目前已知與主要組織相容性復合體(MHC)相關的基因與DCM相關,但可解釋疾病易感性的遺傳貢獻低于50%[11]。因此,利用全基因組篩查或候選基因方法鑒定新型DCM易感性基因是目前的研究熱點。CD247是T細胞受體(TCR)信號級聯的關鍵組成部分,對TCR-CD3復合物的組裝和表面表達重要[7]。有研究表明,所有TCR亞單位中,只有CD247的表達被特異性下調,且這些T細胞影響了TCR介導的功能[12]。考慮到CD247在T細胞反應及自身免疫性疾病中的作用,為闡明該基因在DCM易感性中的作用,有必要分析DCM病人的CD247基因多態性。本研究發現：rs1052237的G變體和rs2056626的C變體可能與DCM的低易感性有關;rs864537的AA基因型可能與DCM病人的LVEF降低有關。

具有rs1052237的G變體DCM病人血清CD247水平較低,但在健康受試者中并非如此,表明該SNP可能僅在病理狀態下通過影響CD247基因的表達而發揮作用。rs1052237位于CD247基因的近5′基因區域,其確切功能尚未明確,且其是否影響DCM疾病狀態下的蛋白質表達和功能有待進一步分析。

SNP rs2056626的次要等位基因與DCM的低易感性有關,其位于N端重復結構域之一,表明其可能參與了TCR信號的調節[13]。有研究顯示,C等位基因的攜帶與類風濕性關節炎病人滑膜T細胞表面CD3ζ密度降低有關[13]。本研究中DCM rs2056626基因型病人血清CD247水平比較差異無統計學意義,推測是由于血清CD247水平不僅與基因型有關,而且與類風濕性關節炎和DCM病人不同的疾病狀態和病理過程有關。雖然SNP rs2056626的變異未改變血清CD247水平,但不能排除其可能通過改變心肌CD247的組織水平影響疾病易感性,需在今后研究中得到證實。有研究顯示,SNP rs864537的遺傳變異可改變一般人群血清CD247水平[14]。本研究結果顯示,這些變體與DCM病人中較低的CD247水平相關,且進一步分析表明,rs864537的次要變異A等位基因與較低的LVEF相關,與血清水平變化一致。

盡管血清CD247水平是心力衰竭預后的獨立危險因素[15],但本研究中的生存分析未發現CD247基因多態性與DCM的預后的關聯,提示基因突變并非是決定CD247血清水平的唯一因素,CD247水平由疾病嚴重程度決定。

本研究的局限性：與DCM易感性相關的顯著CD247基因多態性,但不能排除假陽性結果,遺傳分析中的統計顯著性較小,因此今后在獨立樣本集中進行重復研究以確認結果;未評估組織中CD247基因表達,因此不能從本研究中確認CD247基因中的顯著SNP影響了心臟組織的基因表達并直接參與了纖維化和炎癥;未進行功能分析CD247基因中突變等位基因的影響,無法闡明CD247基因多態性與DCM關聯的確切機制;本研究是一項以醫院為基礎的病例對照/隊列研究,選擇偏倚是不可避免的。

總之,本研究為CD247基因與DCM的潛在臨床關聯提供了一些依據,需進行全面的分析以確認本研究的結果是合理的。今后需探討SNP潛在的細胞生物學機制。