某海水功能飲品中常量離子對脂肪酶的影響

馬敬環，王步月，劉 瑩，高 然

（1.天津工業大學環境科學與工程學院，天津 300387；2.天津海源匯科技有限公司，天津 300359）

海水作為生命的起源，富含90 多種無機鹽、礦物質及微量元素[1]。合理開發和利用海水資源是實現可持續發展的重要措施。隨著合理開發海水資源的深入，海水淡化不僅可解決全球水資源緊缺的問題，也可作為天然的“元素補充劑”，海水中的礦物質元素可調節人體內環境的元素平衡、調整電解質平衡、增強機體免疫力[2]，從而可有效預防慢性亞健康疾病的產生。因此，海水資源化成為當前的研究熱點。

Nakagaw 等[3]證明海水做成礦物質元素飲品是安全的，可以作為優質的元素補給源，且由于其特性與生物活性（容易吸收、天然無污染）在多方面對人體有益，故海水可以加工成為功能性飲品。目前已有研究通過動物實驗從醫學角度證明：海水有助于預防高膽固醇血癥、動脈粥樣硬化[4]和輕度高血壓[5]，且在改善皮炎癥狀[6]、降低總甘油三酯、提高高密度膽固醇脂蛋白和調節肝脂代謝功能[7]等方面有較好效果。從生物化學角度來講，礦物質元素作為生命體所必需7 大營養素之一，參與了多種蛋白質的合成、分泌，甚至影響酶活性及機體代謝。海水中所含的離子可影響酶分子的構象[8]，從而影響其功能與活力；離子在酶促反應中常作為輔助因子參與反應，不同離子以不同方式與酶分子結合參與后續催化反應[9]。Lu 等[10]研究證明金屬離子可以提高脂肪酶的穩定性和水解活性。更有研究[11]證實，在Mg2+離子、Na+離子等存在下脂肪酶的酶活力及穩定性均有所提升。

天津某公司以海水為原料生產的飲品，在推廣應用過程中表現出具有一定的降脂功能。該飲品中含有23 種元素，本文針對該飲品所含常量離子（Mg2+、Ca2+、Na+、K+和B3+）進行研究，通過考察這5 種離子對脂肪酶活力、Zeta 電位、紫外和熒光特性的影響，探討該飲品及其所含5 種離子對脂肪酶的作用機理，以期為該海水功能飲品的功能強化改進提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與儀器

材料：海水功能飲品，天津海源匯科技有限公司產品，其元素組成如表1 所示；豬胰脂肪酶，南京獨萊生物技術有限公司產品；橄欖油、磷酸鹽緩沖液、聚乙烯醇，均為上海麥克林生化科技有限公司產品；NaOH，分析純，阿拉丁試劑公司上海分公司產品；無水乙醇、NaCl、MgCl2、CaCl2、KCl、H3BO3，均為分析純，天津市風船化學試劑科技有限公司產品。

表1 海水功能飲品元素組成Tab.1 Elements of marine functional drinks

儀器：SB-5200-DTDN 型超聲波清洗機，寧波新芝生物科技有限公司產品；SHZ-D 型循環水式多用真空泵，鄭州博科儀器設備有限公司產品；HJ-6C 型恒溫磁力攪拌水浴鍋，金壇市科普實驗儀器廠產品；FSH-2A 型可調高速勻漿機，常州市白塔安瑞實驗儀器廠產品；Malvern Nano ZS90 型納米粒徑及電位分析儀，英國馬爾文儀器有限公司產品；GENESYS 10S 型紫外-可見分光光度計，美國賽默飛世爾科技有限公司產品；F-380 型熒光分光光度計，天津港東科技股份有限公司產品。

1.2 脂肪酶活力的測定

酶活力測定方法[12]參照國標GB/T 23535-2009 進行。通過測量脂肪酶催化油脂水解產生脂肪酸的含量來表征脂肪酶的催化活力。空白組（未加離子）酶活力為100%。某公司海水功能飲品為濃縮液，需稀釋100倍后飲用。飲用時飲品中Mg2+、Ca2+、Na+、K+和B3+離子的濃度分別為8.83、0.04、2.52、0.73 和0.07 mmol/L。參照該飲品中5 種離子的濃度，分別配制不同濃度離子溶液。取適量酶粉溶于5 mL 磷酸鹽緩沖液中，與不同濃度等量的離子溶液混合均勻。空白組加入等量純水，而樣品組酶液離子濃度分別為：Mg2+組2.00、4.00、6.00、8.00、8.83、10.00、12.00 mmol/L；Ca2+組0.02、0.04、0.10、0.50、1.00、2.00、5.00 mmol/L；Na+組1.00、2.00、2.52、3.00、4.00、5.00、6.00 mmol/L；K+組0.50、0.73、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00 mmol/L。B3+組0.03、0.07、0.10、0.50、1.00、2.00、5.00 mmol/L；海水功能飲品組濃度為海水功能飲品原液的1/100。于40 ℃、200 r/min的條件下在恒溫振蕩搖床中培育15 min 得到樣品酶液，測定酶活力。空白組（未加離子）的酶活力為100%，計算樣品組的相對酶活力，進行比較分析。

1.3 脂肪酶活力穩定性的測定

脂肪酶活力隨著時間的推移而出現減弱的現象稱為脂肪酶活力的穩定性。本文通過于15 min 和30 min 培育時間節點測定其酶活力，來表征脂肪酶活力穩定性。樣品酶液均于40 ℃、200 r/min 的條件下在恒溫振蕩搖床中培育，分別在15、30 min 時取出1 mL樣品酶液測量其酶活力。將空白組培育15 min 后的酶活力設定為100%，計算樣品組的相對酶活力。

1.4 脂肪酶Zeta 電位的測定

Zeta 電位的變化可用來考察酶分子的分散機制和酶分子構象的改變[13]。于室溫條件下將適量樣品酶液加入樣品室中，注意檢查室內無小氣泡后，采用Malvern Nano ZS90 型納米粒徑及電位分析儀測定Zeta 電位。

1.5 脂肪酶紫外吸收光譜的測定

通過測量紫外吸光度強度及峰位變化，表征海水功能飲品及其5 種離子對脂肪酶紫外光譜特性的影響。取0.1 g 酶粉溶于純水，定容至100 mL，酶液用不同濃度的Mg2+、Ca2+、Na+、K+、B3+離子溶液和海水功能飲品溶液在室溫下處理成樣品酶溶液。取適量樣品酶溶液于比色皿中，使用GENESYS 10S 型紫外-可見分光光度計于室溫下掃描，波段為190～350 nm。

1.6 脂肪酶熒光發射光譜的測定

通過研究熒光強度及其峰位置的變化程度，考察海水功能飲品及其5 種離子對蛋白質分子微環境及構象的影響[14]。使用F-380 型熒光分光光度計測定酶液熒光光譜，所用樣品配制與紫外光譜中相同。測量參數設置為：激發光300 nm，發射光從280～500 nm 掃描，狹縫寬度10/10，PMT Voltage 950，掃描速率1 200 nm/min。

2 結果與討論

2.1 對脂肪酶活力的影響

海水功能飲品及其5 種離子對脂肪酶活力的影響如圖1 所示。

圖1 海水功能飲品及其5 種離子對脂肪酶活力的影響Fig.1 Effect of marine functional drinks and its five ions on lipase activity

由圖1 可知，Mg2+、Ca2+、Na+、K+、B3+離子組均表現出對脂肪酶活力的促進效果，且與離子濃度呈正相關。Mg2+離子在濃度為8.83 mmol/L 時相對酶活力為129.95%；Ca2+離子在濃度為0.04 mmol/L 時相對酶活力為102.40%；Na+離子在濃度為2.52 mmol/L 時相對酶活力為121.51%；K+離子在濃度為0.73 mmol/L 時相對酶活力為117.95%；B3+離子在濃度為0.07 mmol/L 時相對酶活力為107.94%；稀釋100 倍的海水功能飲品對酶催化活力的促進作用最為顯著，相對酶活力為149.19%。由于海水功能飲品中含有多種離子，其種類與濃度的不同對酶的空間結構和功能所起的作用方式也不盡相同[15]。多種離子可通過影響脂肪酶的活性中心、或者改變環境極性使酶的構象發生改變[16]，促使酶活力顯著提升，因而表現為相對酶活力最強。

2.2 對脂肪酶活力穩定性的影響

海水功能飲品及5 種常量離子對脂肪酶穩定性的影響如表2 所示。

表2 海水功能飲品及其5 種離子對脂肪酶穩定性的影響Tab.2 Effect of marine functional drinks and its five ions on stability of lipase

由表2 可知：空白組脂肪酶培育15 min 后的酶活力為100%，30 min 后空白組的相對酶活力則為79.60%；所有離子組的相對酶活力在15 min 和30 min后均高于空白組，對脂肪酶活力穩定性有不同程度的提升，且提升效果隨著離子濃度的升高而增強；離子組中，當離子濃度與飲品中離子濃度相同時，濃度為8.83 mmol/L 的Mg2+離子對脂肪酶活力穩定性的維持效果最好，15 min 后相對酶活力為129.95%，30 min后的相對酶活力為114.29%，為空白組30 min 后的相對酶活力的1.44 倍；海水功能飲品組15 min 和30 min后的相對酶活力分別為149.19%、139.18%，遠高于單一離子的相對酶活力。

2.3 對脂肪酶影響的機理研究

2.3.1 對脂肪酶Zeta 電位的影響

不同濃度的5 種離子和海水功能飲品對脂肪酶Zeta 電位的影響如圖2 所示。

圖2 海水功能飲品及其5 種離子對脂肪酶Zeta 電位的影響Fig.2 Effect of marine functional drinks and its five ions on zeta potential of lipase

由圖2 可知，伴隨著離子濃度的上升，一價離子（Na+、K+）和B3+增加了Zeta 電位絕對值，二價陽離子（Mg2+、Ca2+）降低了Zeta 電位絕對值。海水功能飲品組的Zeta 電位絕對值為12.18 mV，相比空白組絕對值增加了0.68 mV。Zeta 電位絕對值增加，使分子表面靜電作用增強，粒子之間的排斥力增加[17]，酶液體系變得更分散、更穩定，可使酶分子更好更均勻地分散在溶液中，不易聚集沉淀。其中，一價陽離子比二價陽離子能更有效地提高酶分子的Zeta 電位絕對值。由于離子的加入可改變酶分子表面氨基酸殘基的帶電性，使分子表面所帶電荷量改變，導致部分氨基酸序列重排，最終使酶分子構象改變。海水功能飲品及5 種離子使脂肪酶的Zeta 電位發生明顯改變，證明了海水功能飲品及5 種離子影響了酶分子構象。

2.3.2 紫外吸收光譜分析

海水功能飲品及其5 種離子對脂肪酶紫外光譜特性的影響如圖3 所示。

圖3 海水功能飲品及其5 種離子與脂肪酶作用的紫外光譜Fig.3 UV spectra of lipase interacting with marine functional drinks and its five ions

由圖3 可知，酶液最大吸收峰在194 nm 處，主要是芳香族氨基酸（色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸）或者肽鍵中C—O 基的n-p3躍遷所致[18]。離子濃度越高，酶液的吸光度越大，其中Mg2+離子組吸光度變化最大，酶液吸光度由空白組的2.573 1 增至2.618 9，海水功能飲品組的吸光度為2.678 7，是空白組吸光度的1.041 倍。海水功能飲品及5 種離子通過改變發色基團的微環境極性，使其與助色團相連發生共軛效應，從而影響酶分子的構象[19]，表現為吸光度增加和最大吸收峰位紅移3 nm。而當蛋白質在溶液中構象發生轉變時會影響脂肪酶的結構與功能，表現為對脂肪酶活力的影響[20]。

2.3.3 熒光發射光譜分析

海水功能飲品及其5 種離子對脂肪酶熒光光譜的影響如圖4 所示。

圖4 海水功能飲品及其5 種離子與脂肪酶作用的熒光光譜Fig.4 Fluorescence spectra of lipase interacting with marine functional drinks and its five ions

由圖4 可知，經300 nm 激發后，天然酶內源熒光在304 nm 處有最大發射峰，此處所得的發射峰主要是芳香族氨基酸（色氨酸和酪氨酸）殘基作用的結果[21-22]。樣品組與空白組的熒光強度相比發生了明顯變化，離子濃度的增加致使樣品熒光強度先升高后降低，熒光發射峰位基本沒有出現位移現象，且峰型無明顯變化。這說明發生在5 種離子與脂肪酶之間的作用一定程度上影響了脂肪酶分子的結構[23]，從而表現為熒光強度先升后降的趨勢。海水功能飲品組的熒光強度最高，為2 529.865，比空白組升高1 152.861。熒光反映生色團所處微環境的信息[14]，海水功能飲品中多種離子的存在，改變了溶液極性，使蛋白質微環境極性增強，致使蛋白質分子構象改變，熒光強度升高[24]。

3 結論

通過對飲品及其5 種常量離子（Mg2+、Ca2+、Na+、K+、B3+）對脂肪酶催化活力、Zeta 電位及光譜特性的影響進行分析，得出如下結論：

（1）5 種離子對脂肪酶的活力及穩定性均有促進作用，且隨離子濃度的升高而增強，海水功能飲品對脂肪酶促進效果最顯著。

（2）一價陽離子（Na+、K+）和B3+比二價陽離子（Mg2+、Ca2+）能更有效地提高酶分子的Zeta 電位絕對值。海水功能飲品使酶分子的Zeta 電位絕對值增加，證實氨基酸殘基帶電性發生變化，導致氨基酸序列重排，影響酶分子區域構象，使酶液體系變得更分散，不易沉淀。

（3）5 種離子均使脂肪酶的紫外吸收和熒光強度在一定濃度范圍內增大。與空白組相比，海水功能飲品組紫外吸光度是空白組的1.041 倍，最大吸收峰紅移3 nm，而熒光強度增大1 152.861，表明海水功能飲品中的5 種離子可能通過影響微環境極性，使其與助色團相連發生共軛效應，從而導致酶分子構象改變，影響脂肪酶的結構與功能，表現為對脂肪酶活力的提升。