乳腺癌中KAI1與血管生成擬態的臨床意義探討*

趙云霞 崔芳芹 蔡兆根

蚌埠醫學院 1 病理生理學教研室 2 病理學教研室,安徽省蚌埠市 233030

近期Chemical Abstracts正式發表了基于185個國家的癌癥統計數據,數據顯示乳腺癌是女性發病率最高的癌癥(占總病例的11.7%),也是主要的癌癥死亡原因(占6.9%),乳腺癌已成為全球頭號癌癥[1]。腫瘤生長需要氧和營養物質的供應,血管增生是腫瘤生長的關鍵環節。傳統觀念認為腫瘤中增生的血管是內皮依賴性血管。近年來的研究顛覆了傳統的認知,腫瘤生長所需血液供應并非只來源于有內皮的毛細血管,血管生成擬態(VM)也是腫瘤血液供應的模式之一,各種血管模式在腫瘤生長不同時期可能擔負著不同的任務。早期可能以VM為主,隨著腫瘤生長,馬賽克血管逐漸增加,后期內皮依賴性血管成為腫瘤血液供應的主要方式。認為VM在腫瘤早期的生長、侵襲和轉移中可能起了重要作用。KAI1是重要的腫瘤抑制基因,其表達的蛋白為四次跨膜蛋白,能夠調控膜分子的信號轉導,抑制腫瘤的進展和轉移。乳腺癌中KAI1與VM間的關系并不明確。本研究通過對乳腺癌病理標本中KAI1和VM的檢測與分析,試圖尋找預測乳腺癌生長、浸潤、轉移及預后的指標。

1 材料和方法

1.1 材料 來源于我院病理教研室(第一附屬醫院病理科),存檔的乳腺癌石蠟標本94例,同時收集20例乳腺良性增生性病變組織作為對照,其中10例為2021年存檔標本,84例存檔時間為2015和2016年兩年,所有病例術前均未行其他治療,且均有完整臨床病理資料及隨訪資料。隨訪時間為6～72個月。KAI1鼠抗人單克隆抗體購于abcam,CD34鼠抗人單克隆抗體購于珠海貝索公司,ElivisionTMplus試劑盒及DAB顯色試劑盒均購于福州邁新公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 免疫組化。ElivisionTMplus法,石蠟標本4μm切片、烤片、烘干,脫蠟至水。染色操作按照試劑盒說明進行。PBS液代替一抗作為陰性對照,已知陽性片作為陽性對照。

1.2.2 CD34+PAS套染。CD34染色操作同上免疫組化進行,顯色后先自來水沖洗;后于0.5%高碘酸溶液中進行氧化,自來水沖洗;然后于雪夫染液(Schiff)中反應,自來水沖洗;返色,細胞核復染,脫水,封片。

1.3 結果判定

1.3.1 KAI1免疫組化結果判定。以膜和胞質出現棕黃色顆粒為陽性表達。本研究采用半定量的方法,染色強度乘以染色范圍的數值作為評判標準。兩者乘積>3分者為陽性,余為陰性。染色強度判斷由淺到深：無著色、淺黃色、棕黃色、棕褐色分別記為0分、 1分、2分和3分;染色范圍判斷由小到大：無陽性細胞、≤10%、11%～50%、51%～75%、>75%則分別記為0分、1分、2分、3分和4分。結果由兩位高年資病理醫生雙盲評定。

1.3.2 VM判定。經CD34+PAS套染判定VM CD34陽性表達為胞膜和胞質出現棕黃色顆粒。由于VM是由腫瘤細胞圍繞形成管腔樣結構,內壁并無內皮細胞襯覆。因此標記內皮的CD34為陰性,而管腔內壁基底樣結構可被PAS染成紅色的。

1.4 統計學方法 采用SPSS22.0軟件對數據進行處理。KAI1和VM與各臨床病理參數間關系采用χ2檢驗或Fisher精確概率法,Spearman等級相關分析KAI1與VM間的相關性,KAI1和VM陽性組與陰性組生存分析采用Kaplan-Meier法。P<0.05時差異有統計學意義。

2 結果

2.1 乳腺癌中KAI1的表達 KAI1在乳腺癌組中表達率為30.85%(29/94);對照組中僅有1例未檢出,表達率為95.00%(19/20)。乳腺癌中KAI1的表達顯著低于對照組,兩組比較有統計學差異(P<0.01)。見圖1、表1。

圖1 KAI1陽性染色

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表1 乳腺癌組織中KAI1表達

2.2 乳腺癌中VM檢出及與臨床病理參數間的關系 VM由高度惡性腫瘤細胞自身形成,腫瘤細胞圍繞排列形成管腔樣結構,管道內壁無內皮細胞,PAS染色呈紅色基底膜樣結構(見圖2)。本組病例中有33例檢出VM,檢出率為39.29%(33/84),對照組均未見VM結構,兩組差異有統計學意義(P<0.01)。雖然VM與各臨床病理參數間均無相關性(見表2),但隨腫瘤增大,VM陽性率逐漸增高,陽性率分別為25.00%、44.64%和50.00%。TNM分期中,Ⅰ、Ⅱ期VM陽性率逐漸增高21.43%和50.00%,但Ⅲ期又明顯降低36.00%,與目前對VM的認知是相符的。

表2 乳腺癌組織中KAI1、VM表達與臨床病理指標間的關系

2.3 乳腺癌中KAI1的表達及與臨床病理參數間的關系 有完整病理參數和隨訪資料的84例乳腺癌組織中淋巴結轉移組KAI1表達率為20.41%(10/49),淋巴結轉移陰性組為45.71%(16/35),兩組有統計學差異(P<0.05)。腫瘤TNM分期Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期KAI1表達率分別為64.29%、23.53%及25.00%,Ⅰ期與Ⅱ、Ⅲ期間差異有統計學意義(P<0.05),與其他臨床病理指標均無相關性。見表2。

2.4 乳腺癌中KAI1與VM間的關系 VM陽性組KAI1陽性率15.15%(5/33),VM陰性組其陽性率為41.18%(21/51),兩組差異有統計學意義。Spearman等級相關分析,KAI1與VM間呈負相關(r=-0.275,P<0.05)。見表3。

表3 乳腺癌組織中KAI1與VM間的關系

2.5 生存分析 Kaplan-Meier法分析KAI1表達和VM檢出情況對患者生存時間的影響,發現KAI1蛋白陽性組和陰性組的平均生存時間分別為55.50個月和36.68個月,兩組有差異(P<0.05)。VM檢出陽性組和未檢出組平均生存時間分別為33.39個月和48.81個月,兩組差異有統計學意義(P<0.05)。見圖3。

圖3 KAI1及VM不同狀態下乳腺癌患者生存曲線

3 討論

腫瘤生長依靠血液提供氧和營養物質,因此抗血管生成治療成為腫瘤治療的一種方式。針對血管內皮的抗血管生成藥物已廣泛應用于臨床,卻表現出局限性和耐藥性,此現象說明腫瘤細胞可能存在其他方式獲取所需營養物質。VM可能是腫瘤抗血管治療失敗的原因。

VM是近年來由Folberg等[2]定義的一種新的腫瘤血液供應模式。VM的提出是對傳統腫瘤血管生成認知的挑戰和補充。其不同于傳統意義上腫瘤內血管的形成,其發生與腫瘤細胞的重塑有關,即腫瘤細胞的上皮間質轉化。腫瘤細胞變形圍繞形成類似于血管的管狀結構,但腔內無內皮細胞,取而代之的是一薄層的基底膜樣結構。而且認為VM是腫瘤早期生長中提供氧和營養物質的重要途徑,隨著腫瘤不斷生長,內皮依賴性血管則會逐漸增加,成為主要血液供應方式。正是由于VM在腫瘤生長的早期出現,且管壁薄,通透性高,所以更有利于癌細胞的早期侵襲和轉移。本組病例中近40%有VM檢出,且隨腫瘤增大,VM檢出率有增加趨勢;在TNM分期的Ⅱ期中,VM檢出率明顯增高,數據經統計學處理后未發現有統計學意義,可能由于樣本量較少,但這一變化趨勢符合當前對VM的認知[3]。Kaplan-Meier生存分析顯示,VM陽性病例生存時間顯著低于VM陰性者,兩組差異有統計學意義。提示VM檢出意味著患者預后差,可能與VM形成更有利于腫瘤的侵襲和轉移有關。

KAI1是目前公認的廣譜抑癌基因,研究表明其可抑制胃癌、食管癌、腸癌、胰腺癌等多種惡性腫瘤的侵襲和轉移[4-7],有望成為抗腫瘤治療的新靶點。通常認為,KAI1主要通過抑制腫瘤組織中的血管生成[8],從而達到抑制腫瘤的生長和轉移。本組病例中近70%的患者KAI1陰性表達,有淋巴結轉移組病例其表達率顯著降低,且KAI1表達與腫瘤TNM分期相關,此與目前在胃癌及腎癌等腫瘤中[9-10]的研究結果相一致。生存分析發現,KAI1表達陰性組5年生存率顯著低于陽性組。此結果提示,KAI1的表達缺失促進乳腺癌的生長和轉移,與患者不良預后密切相關。

進一步分析KAI1蛋白表達與VM間的關系發現,KAI1蛋白的表達與VM兩者之間呈負相關,KAI1表達陰性組VM陽性率顯著增高。由此推測KAI1蛋白表達缺失不僅促進的腫瘤血管的形成,更重要的是在腫瘤早期它可能促進VM形成,使腫瘤獲得營養物質,促進乳腺癌的生長和早期轉移,導致預后不良。同時KAI1蛋白表達的缺失可能通過調控細胞黏附分子,使細胞與細胞及細胞與細胞外基質間的黏附性降低,細胞更易于脫落,進入管壁薄、通透性強的VM中,實現腫瘤的浸潤和遠處轉移[11]。這將是我們下一步的研究方向。

綜上所述,VM是乳腺癌侵襲和轉移的關鍵一環,KAI1可能參與調控VM形成的過程,具體機制將是我們下一步研究的重點內容。希望這一結果能為臨床乳腺癌治療研究提供點滴線索。