耳聾基因檢測(cè)在新生兒聽力篩查中的應(yīng)用

欒海萍

上海市普陀區(qū)婦嬰保健院檢驗(yàn)科 200062

聽力障礙是最常見的出生缺陷之一,國內(nèi)外報(bào)道發(fā)生率為1‰～3‰,經(jīng)過ICU搶救過的新生兒發(fā)生率更高。若是按照我國每年出生1 900萬新生兒計(jì)算,每年新增2萬～3萬聽力障礙兒童[1-4]。聽力障礙后果不僅在于“聾”,而且在于“啞”,特別是遲發(fā)性耳聾發(fā)病率高,在新生兒中發(fā)病率為1.33‰,4歲兒童的發(fā)病率為2.7‰,青少年中為3.5‰。研究發(fā)現(xiàn)我國耳聾基因的熱點(diǎn)譜存在地域差異性[5],本研究以近年來出生的2 916例新生兒為研究對(duì)象,采用PCR擴(kuò)增法和導(dǎo)流雜交相結(jié)合的方法,對(duì)耳聾基因GJB2、GJB3、SLC26A4、mtDNA的13個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 選擇2018年6月—2022年6月在我院出生的2 916例新生兒為研究對(duì)象,其中男1 516例,女1 400例。新生兒家長(zhǎng)均在新生兒科醫(yī)生充分告知的情況下,自愿簽署知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 標(biāo)本采集：由新生兒醫(yī)生采集,采集新生兒腳底末梢血制成血斑卡,晾干后每張血斑卡使用獨(dú)立的自封卡,送至檢驗(yàn)科標(biāo)本接收處,通過簽收血斑卡保證檢驗(yàn)前質(zhì)量控制。

1.2.2 核酸提取：采用打孔器對(duì)血斑卡均勻打取3～4個(gè)干血片置于1.5ml離心管中,采用凱普生物全血細(xì)胞DNA提取試劑盒的離心柱法提取DNA。

1.2.3 核酸擴(kuò)增及導(dǎo)流雜交：對(duì)13個(gè)GJB2(35delG、176-191del16、235delC、299-300delAT、155delTCTG),SLC26A4(2168A>G,IVS7-2A>G、1229C>T),GJB3(538C>T),mtDNA(1494C>T、1555A>G、12201T>G、7445A>G)基因位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物,采用PCR擴(kuò)增儀為Bioer Life Express進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。并對(duì)擴(kuò)增反應(yīng)物通過變性,對(duì)變性產(chǎn)物用核酸分子雜交儀HB-2012A雜交反應(yīng),并設(shè)置相應(yīng)質(zhì)控點(diǎn),保證雜交質(zhì)量。

1.2.4 驗(yàn)證方法：為保證結(jié)果的準(zhǔn)確性,雜合突變采用重新提取DNA復(fù)查的辦法,純合突變和異常突變(正常點(diǎn)和突變點(diǎn)均未顯色)Sanger測(cè)序。使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)(PCR)對(duì)突變基因目標(biāo)位置進(jìn)行擴(kuò)增,并采用特異性引物進(jìn)行 Sanger 測(cè)序檢測(cè)。特異性引物的設(shè)計(jì)是專門針對(duì)目標(biāo)位點(diǎn),并覆蓋該位點(diǎn)上下游的序列;標(biāo)本檢測(cè)得到的序列與 NCBI 所提供 基因參考序列進(jìn)行比對(duì)和注釋。突變的表述參照 Human Genome Variation Society (HGVS) version 15.11進(jìn)行。

1.2.5 質(zhì)量控制：采用空白對(duì)照作為陰性質(zhì)控﹑以往陽性標(biāo)本作為陽性質(zhì)控監(jiān)測(cè)擴(kuò)增過程,雜交過程由生物素標(biāo)記點(diǎn)作為監(jiān)測(cè)。并參加上海市臨檢中心室間質(zhì)控作為實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量保證。

2 結(jié)果

2.1 篩查結(jié)果分析 2 916例新生兒共篩查出138例耳聾基因突變,總陽性率為4.7%,GJB2-235基因突變率最高。上海普陀地區(qū)常見的耳聾基因GJB2和SLC26A4,熱點(diǎn)突變位點(diǎn)是GJB2的235delC、SLC26A4的IVS7-2A>G位點(diǎn)。其他復(fù)合突變：mtDNA-1555純合突變、SLC26A4-IVS7-2雜合突變的復(fù)合突變。GJB2-235的雜合突變、SLC26A4-IVS7-2雜合突變的復(fù)合突變。見表1。

表1 2 916例新生兒耳聾基因篩查突變表

2.2 異常突變點(diǎn)一代測(cè)序驗(yàn)證結(jié)果 在2 916例標(biāo)本中,有6例異常突變的標(biāo)本,分別是1.7445正常點(diǎn)和雜合突變點(diǎn)均未顯色,Sanger測(cè)序?yàn)?443均質(zhì)突變,其突變影響了探針結(jié)合,該突變?yōu)闊o義突變,不致病。2.1494正常點(diǎn)和雜合點(diǎn)未出,Sanger測(cè)序?yàn)?503處發(fā)生均質(zhì)突變。3.7445正常點(diǎn)顯色很淡,Sanger測(cè)序?yàn)?443(A>G)的多態(tài)性。4.1494和1555正常點(diǎn)顯色很淡,Sanger測(cè)序?yàn)閙tDNA m.1709G>A和m.1716T>C均質(zhì)突變,致病性不明。1494位點(diǎn)和1555位點(diǎn)未見突變。5.7445正常點(diǎn)和雜合突變點(diǎn)均未顯色,Sanger測(cè)序?yàn)?443A>G,其突變影響了7445探針結(jié)合,該突變致病性不明,見圖1。6.1494點(diǎn)淡,測(cè)序顯示多態(tài)性。

圖1 mtDNA基因7445位點(diǎn)測(cè)序圖

2.3 純合突變一代測(cè)序驗(yàn)證結(jié)果 在2 916例標(biāo)本中,有7例純合突變,一代測(cè)序驗(yàn)證情況均符合雜交結(jié)果,其中1例GJB2-235純合突變,通過隨訪發(fā)現(xiàn)該新生兒兩耳聽力未過。由于該突變一般無法通過物理聽力篩查,聽力基本喪失,經(jīng)確診后建議進(jìn)行干預(yù)治療(佩戴助聽器,人工耳蝸植入術(shù))。此外,做好婚育或產(chǎn)前遺傳咨詢,即將來其配偶也應(yīng)進(jìn)行婚育前耳聾基因檢測(cè),必要時(shí)可進(jìn)行產(chǎn)前診斷以確認(rèn)后代耳聾基因的攜帶情況。由于我院沒有耳鼻喉科,故轉(zhuǎn)診到上級(jí)醫(yī)院進(jìn)行隨訪,后續(xù)隨訪結(jié)果為盡快植入人工耳蝸。其余6例聽力篩查均通過,線粒體DNA均質(zhì)突變患者應(yīng)終生禁用耳毒性藥物,見圖2、3。

圖2 導(dǎo)流雜交膜條

圖3 耳聾基因mtDNA1555均質(zhì)突變測(cè)序圖

3 討論

聽力障礙作為殘障性疾病,在新生兒群體中較常見。新生兒聽力篩查作為新生兒重點(diǎn)篩查疾病之一,衛(wèi)生部于2010年頒布的《新生兒聽力篩查技術(shù)規(guī)范》中提出,應(yīng)盡早發(fā)現(xiàn)聽力障礙個(gè)體,予以及時(shí)、有效干預(yù),以防聾致啞[6]。近年來,隨著新生兒聽力篩查的研究不斷深入,發(fā)現(xiàn)單純聽力篩查可

能造成藥物性耳聾基因攜帶者以及遲發(fā)性耳聾患兒的漏診,因此,自2007年臨床推薦在常規(guī)聽力篩查基礎(chǔ)上應(yīng)聯(lián)合基因篩查。遺傳性耳聾分為綜合征性耳聾和非綜合征性耳聾,其中非綜合征性耳聾約占70%。根據(jù)流行病學(xué)調(diào)查,非綜合征性耳聾絕大多數(shù)為單基因遺傳病,我國非綜合性耳聾主要由GJB2、GJB3、SLC26A4、mtDNA引起[7-9],所以針對(duì)新生兒的耳聾基因和聽力篩查可以了解他們是否攜帶耳聾基因和聽力損失情況。通過進(jìn)一步檢測(cè)來決定是否需要干預(yù)性治療,讓兒童不錯(cuò)過學(xué)習(xí)語言的最佳時(shí)期。由于聽力下降是一個(gè)過程,所以對(duì)于純合突變和復(fù)合雜合突變的病例,也應(yīng)建議進(jìn)一步進(jìn)行耳鼻喉科的隨訪。耳聾嚴(yán)重影響個(gè)人的生活質(zhì)量,降低生活幸福指數(shù)。

在2 916例耳聾基因篩查中,總陽性率為4.7% ,陽性位點(diǎn)攜帶率與國內(nèi)文獻(xiàn)基本接近[10-11]。巫靜帆等[12]對(duì)33 810例新生兒聽力篩查與聾病易感基因篩查進(jìn)行分析時(shí)發(fā)現(xiàn),GJB-2基因突變發(fā)生率最高,為1.96%。另一項(xiàng)研究顯示GJB-2基因突變率最高,突變頻率為2.57%,GJB2純合突變引起的先天性重度耳聾使用耳蝸干預(yù)性治療,效果良好[13]。本研究中,GJB-2基因突變點(diǎn)最高,為2.1%,雜合突變點(diǎn)共61例,其結(jié)果與之相符。SLC26A4基因突變率為1.37%,該基因即“一巴掌致聾”,帶有該基因的病人應(yīng)避免外力碰撞對(duì)耳朵的傷害。研究表明,SLC26A4基因是僅次于GJB-2基因突變所致的感音神經(jīng)性聾的遺傳學(xué)病因[14]。SLC26A4基因突變與大潛艇導(dǎo)水管綜合征存在密切關(guān)聯(lián),其典型表現(xiàn)為前庭導(dǎo)水管擴(kuò)大,同時(shí)伴有感音神經(jīng)性或混合性耳聾,其純合突變、雙雜合突變均是致聾的重要因素。GJB-3基因是國內(nèi)本土克隆和鑒定的第一個(gè)遺傳聾病基因,易引起遲發(fā)性聾病,多數(shù)患者在青年時(shí)期表現(xiàn)為聽力正常,隨著年齡增長(zhǎng)進(jìn)入青壯期聽力逐漸降低,直至發(fā)展為重度聾病,其基因突變的原因與高頻聽力下降相關(guān)。李欣欣[15]研究結(jié)果顯示,GJB-3基因突變?yōu)?.27%,該研究證實(shí)該基因?yàn)槌Ｈ旧w顯性遺傳,攜帶此基因新生兒應(yīng)長(zhǎng)期監(jiān)測(cè)聽力問題,以便盡早發(fā)現(xiàn)聽力異常。本研究中,GJB-3基因突變率為0.44%,耳聾基因突變被證實(shí)與高頻聽力下降有關(guān),一般發(fā)病為青少年期或者成人期,是一種遲發(fā)性耳聾基因。mtDNA基因?qū)倌赶颠z傳,常見的兩種突變類型為1494C和1555A,且存在同質(zhì)性和異質(zhì)性突變,兩種突變本研究中突變率為0.23%,帶有該突變基因的新生兒禁止使用氨基糖苷類藥物。

一個(gè)耳聾患者會(huì)耗費(fèi)大量的社會(huì)資源,大多數(shù)聽力缺陷兒童來自聽力正常家庭,由于聽力篩查具有太多局限性,結(jié)合耳聾易感基因篩查可以提早干預(yù),避免“一巴掌致聾”和“一針致聾”的悲劇發(fā)生。