基于電子順磁共振波譜法的土壤環境持久性自由基的檢測方法研究①

蔣 倩，唐昊冶，劉 云，陸國興，倪 俊，涂勇輝，范巧君，龔 華，馬作豪

基于電子順磁共振波譜法的土壤環境持久性自由基的檢測方法研究①

蔣 倩，唐昊冶，劉 云，陸國興，倪 俊，涂勇輝，范巧君，龔 華，馬作豪

(中國科學院土壤環境與污染修復重點實驗室(南京土壤研究所)，南京 210008)

本研究以不同類型土壤為研究對象，分別對電子順磁/自旋共振波譜儀(EPR/ESR，X-波段連續波)的中心磁場、微波功率、調制幅度等主要測試參數進行調試與優選，確立EPR測定土壤環境持久性自由基(EPFRs)的儀器參數優選方法及參考值。結果表明，根據樣品實測頻率(約9.82 GHz)與EPFRs的因子可設置譜儀中心磁場約3 502 G。微波功率可采用微波功率飽和曲線法、微波衰減相鄰6 dB信號比較法優選，兩法各有優缺點，建議結合選用。若與27 dB相比，微波衰減設置為≤15 dB，低場峰(=2.003 0 ～ 2.003 5)有由于功率飽和而引起其自旋濃度被不同程度抑制的趨勢，并且27 dB左右(25 ～ 30 dB)被認為是該峰的較優微波衰減值。然而，高場峰(=2.000 4)對其響應存在差異，高衰減值為較佳。此外，調制幅度應小于峰-峰寬(3.28 G)，若兼顧研究較窄峰(約 1 G)，1 G較為適宜。本EPR譜儀測試參數優選方法可確保因子的準確度、EPR圖譜的分辨率與超精細分裂等信息的可靠性，為土壤與環境固態樣品EPFRs的測定提供科學依據，促進該項技術的應用與發展。

電子順磁共振；電子自旋共振；波譜法；環境持久性自由基；土壤

環境持久性自由基(environmental persistent free radicals，EPFRs)是分子結構極為穩定、半衰期較長的新型環境污染物，可以穩定存在數分鐘至幾十天左右[1]。研究表明，EPFRs廣泛存在于天然有機質和土壤沉積物等環境介質中[2–6]。其中，土壤沉積物中EPFRs主要源于工業熱處理過程與人類的活動，比如煤炭與秸稈的燃燒，以及汽車尾氣的釋放等[7]。近年來，研究人員對土壤EPFRs形成與有機質、金屬離子及污染物的相互作用進行了大量的研究并取得進展。比如土壤有機質中的腐殖酸和金屬離子等能夠與土壤中的含氯農藥等有機污染物作用產生多酚類自由基[8]，并且在土壤腐殖質和類腐殖質中也發現半醌類自由基的存在[9]。土壤EPFRs形成來源于有機質、土壤無機礦物質或者金屬離子等與有機污染物相互作用，并且有機污染物與黏土礦物的結合對EPFRs 形成和穩定起著重要作用[10]。目前，也有土壤EPFRs濃度與Fe3+、Cu2+等金屬離子含量呈正相關關系的報道[11]。但Aeschbacher等[3]則提出了土壤有機質能夠作為電子導體，使有機污染物在不與金屬離子接觸的條件下發生電子轉移，也可產生EPFRs。這些研究結果表明，EPFRs是有機污染物環境歸趨的重要組成部分，且與土壤無機礦物及過渡金屬位點的結合會提高其穩定性和持久性，使其有條件進行長距離、不同環境介質的遷移與轉化，可能增大了潛在的環境風險[12–13]。另一方面，EPFRs也正在被研究者應用在污染物降解的研究中，其可以激發雙氧水和過硫酸鹽產生羥基和硫酸根等自由基，這些活性組分可用于降解有機污染物[14–16]。可見，如果將具有高活性、高反應性的EPFRs 影響有機和無機污染物轉化這一特性應用到土壤與環境催化領域，將對解決目前國內外一些環境污染問題具有重要的意義。

國內外研究中，EPFRs的主要檢測方法是電子順磁共振波譜法/自旋共振(electron paramagnetic/spin resonance，簡稱EPR/ESR)波譜法[1]。基本原理是未配對電子在磁場中吸收頻率v的電磁輻射，若吸收能量與能級間間距?E相匹配，則會發生塞曼躍遷與順磁共振現象。該方法可直接檢測樣品中自由基，是一種可原位、無損和直接跟蹤含有未配對電子的技術方法，具有檢測速度較快、無干擾，且對后續分析測試項目無影響等優點[17]。其不足之處是對樣品管與制備均有相應的要求，比如石英材質樣品管介電損耗更低、更利于微波場分布而被選用；樣品管形狀大小受限于樣品的性質，如固體粉末需選用直徑3 ～ 4 mm的圓柱形管；瞬態自由基通常需現場即時捕獲等[18]。EPR圖譜信息中，因子反映未成對電子的自旋角動量與軌道角動量之間的耦合，是表征自由基的重要參數[19]。對EPFRs 的因子進行解析可獲知其類型信息，若因子為2.002 8，則表明EPFRs以碳為中心，如芳烴類自由基[4，6，20]；若因子為2.003 0 ～ 2.004 0，則表明EPFRs以碳氧為中心或是碳中心與氧中心的混合物[13，21–22]；若因子值大于2.004 0，則EPFRs是以氧原子為中心，如半醌自由基[23]。可見，因子信息有助于解析信號的來源和磁性粒子的性質，進而獲悉土壤的污染來源及類型[24]。同時，該法也可對圖譜峰進行自旋濃度的定量分析。目前，電子順磁共振波譜法已廣泛應用于土壤、生物質炭等介質中EPFRs的檢測[25–27]。然而，關于順磁共振波譜儀測定EPFRs適宜參數的研究報道較少，這不僅會影響自由基定性定量的可靠性，也會在一定程度上制約該技術的應用。本研究以不同類型土壤EPFRs為研究對象，對EPR譜儀的主要測試參數進行逐一調試與優選，旨在建立準確的譜儀參數優選方法，促進該技術在土壤與環境固態樣品EPFRs測試中的應用與發展。

1 實驗部分

1.1 儀器

電子天平(ML503T，梅特勒，瑞士)；電子順磁共振波譜儀(X波段連續波，E-500 9.5/12，布魯克，德國)。

1.2 試劑

為了確保電子順磁共振波譜法測試數據的準確性和可靠性，定期采用相應的標準試劑，遵照檢定規程以及儀器商提供的使用指南對EPR譜儀進行檢定與校準[28–30]。以下試劑均由布魯克公司提供。

錳標，Mn2+為六重峰，第三峰(=2.032 7±0.000 2)與第四峰(=1.980 3±0.000 2)的間隔為9.076 mT。六重分裂的間隔從低場到高場稍有增加，線寬也如此[18]，校準磁場等。

弱酶 (weak pitch，WP)，=2.002 8±0.000 2，檢驗儀器噪聲水平等。

強酶 (strong pitch，SP)，=2.002 8±0.000 2，校準儀器定量等。

BDPA苯自由基絡合物(bis diphenyl allyI- benzene complex)，=2.002 54±0.000 32，校準儀器調制幅度、相位、數據質量控制等。

丙氨酸片(alanine)，其電子自旋數的參考值為1.43×1017，數據質量控制。

1.3 樣品

本研究選用土壤樣品S1 ～ S8涉及沉積物、棕壤、潮壤、水稻土等多種土壤類型，并且有機質(OM)、過渡金屬含量差異較大(表1)，更多理化指標參見標準物質證書。其中，S1 ～ S6為購自河北廊坊地球物理地球化學勘查研究所土壤標準樣品。S7、S8分別取自河南封丘、江蘇常熟的土壤樣品，土樣經風干，剔除植物殘體、植物須根與石塊等侵入體后，用瑪瑙研缽研磨，按照土壤研磨四分法，分別過2 mm (10目)、0.25 mm(60目)、0.149 mm(100目)孔徑尼龍篩，待用[30]。

表1 土壤樣品基本性質

注：有機質 (OM) 及S7和S8樣品的相關數據均是本文測定值，其余數據源自標準物質證書。

2 結果與討論

2.1 樣品高度與質量的選擇

稱取土壤樣品的質量由其強度決定，樣品高度應小于諧振腔的靈敏上限值。本研究使用譜儀諧振腔型號為ER4122SHQE-W1，樣品高度最佳靈敏上限值為20 mm。EPFRs檢測中，應視樣品的信號響應強度與譜儀的調諧難易程度等情況來選擇適宜的樣品質量。據圖1，樣品S1 ～ S6分別置于內徑為4 mm石英管中，其高度分別從10 mm增至15 mm、20 mm，譜儀的值會逐漸降低，其下降范圍為6 000 ～ 2 400，意味著儀器靈敏度隨著樣品高度的增加而下降，這是由于土壤樣品內金屬對微波的介電損耗造成的。本文為了保持譜儀的較高靈敏度與所有研究樣品具有較高信號強度(圖1)，選用樣品高度中間值15 mm。

圖1 不同高度樣品的響應

此外，本文對具有相同樣品高度且目數不同的土壤S7、S8中EPFRs進行了研究。從圖2可知，10目、60目、100目土樣的峰強無明顯差異。在檢測過程中，觀察到譜儀諧振腔品質因子值存在較小波動(范圍分別為2 800 ～ 2 600、2 000 ～ 1 900)，這種現象可能是同高度且不同孔徑的樣品間存在質量差異而引起的。為了盡量確保儀器條件一致，實際樣品應盡量與標樣目數保持一致或相近，即優先選擇100目。

在保持樣品約15 mm的相同高度情況下，土壤S1 ～ S8的質量約在0.162 9 ～ 0.267 8 g(表2)。為了控制自旋濃度的定量偏差，應準確稱量樣品質量至0.000 1 g。當然，也可在儀器靈敏上限的樣品高度前提下，選擇某一相同樣品質量。

表2 電子順磁共振波譜法測定土壤EPFRs

注：Wpp為譜峰寬；Δpp為峰–峰寬；為品質因子。

2.2 中心磁場、掃描寬度的選擇

據0、、因子的計算關系[17]，可計算出中心磁場0：

式中：0，磁場強度，單位為高斯(G)；，測試時實際頻率，單位為吉赫茲(GHz)。對于樣品S1 ～ S6中低場峰，實際頻率約為9.82 GHz，則可計算出中心磁場約為3 502 G。

圖譜掃描寬度一般設置為檢測峰寬的2 倍～ 3倍，即整峰寬占整張EPR圖譜的1/2 ～ 1/3較為適宜，也可根據自己的實際需求進行調整。據表2，本研究樣品峰寬在14.8 ～ 45.1 G范圍，可設置掃描寬度為100 G。面對未知樣品EPR圖譜的中心磁場或因子的情況，可先以譜儀默認中心磁場為中心，設置較大掃寬進行掃描，初步確定峰信號后，再鎖定小范圍進行優選掃描。

2.3 微波功率的選擇

由于化學結構的差異，各物質具有自身特征飽和功率，甚至在溫度等測試條件變化時其值也會有所不同。只有譜儀微波功率設置未飽和值時，EPR信號強度才正比于微波功率的平方根。并且，最佳功率應設為略低于飽和功率[19]。可見，獲取并掌握微波功率的飽和值尤為重要，常用方法有：微波功率飽和曲線法、相鄰微波衰減6 dB信號比較法等[30]。

2.3.1 微波功率飽和曲線法 根據儀器使用指南[30]，在確立峰中心磁場與掃描寬度的條件下，設置微波衰減為0 ～ 60 dB，步長為1 dB，可獲得一組61張磁場-功率二維EPR圖譜。對這組圖譜進行基線校準、洛倫茲偏差線型擬合、線型與微波功率的函數創建，從0 mW起畫一條直線與曲線的相切值，再開平方即為飽和功率。

參照上述步驟，可獲得樣品S1 ～ S8峰(=2.003 3)的微波功率飽和曲線圖(圖3)。從圖中可讀出直線與該曲線相切點約為0.473 ～ 1.939 mW，對應的微波衰減值約21 ～ 26 dB，趨向集中在23 ～ 24 dB范圍內(表3)。顯然，該方法可準確地實現微波功率的優選，但由于耗費儀器機時較長(不少于40 min)，其廣泛使用受到了限制。

圖3 土壤S1 ～ S8微波功率飽和曲線圖

表3 兩種方法對多類土壤EPFRs的微波功率優選結果對比

注：①微波功率飽和曲線法；②相鄰微波衰減6 dB信號比較法。

2.3.2 相鄰微波衰減6 dB信號比較法 以6 dB為步長，相鄰兩個未達飽和微波功率條件下EPFRs信號強度間存在2倍或1/2的關系。通過直接比較這兩個相鄰信號強度的大小可判斷飽和范圍值。不同微波功率下，S1 ～ S8中EPFRs低場峰實測信號與微波衰減的關系見圖4。以S1為例，判定步驟：①從9 dB到27 dB，2倍較大微波衰減信號(如27 dB)均小于相鄰較小者(21 dB)，則其較小微波功率被判定為處于飽和狀態；②2倍微波衰減33 dB信號約等于27 dB，可判斷微波衰減的最佳選擇在27 ～ 39 dB范圍。據圖2可知，土壤樣品S2 ～ S8的響應結果盡管存在細微差異，但微波衰減值仍趨同于21 ～ 33 dB范圍內。文獻報道[2，4，26，31]中，微波衰減20、23、25、30 dB均有被采用，本文研究結論基本一致。在選用時，應基于實際樣品峰強弱進行選擇，較弱峰可選較高功率，即較低微波衰減值。值得注意的是，需定量的樣品應謹慎選擇高功率參數，比如，在20 dB時S1 ～ S8(除S2外)EPFRs其自旋濃度的值會受到不同程度的抑制已被證實(圖4)。并且，由圖4可知，與27 dB相比(除S2與21 dB比)，在微波衰減≤15 dB時，所有樣品由于微波功率飽和而被不同程度地抑制(3.5% ～ 98.3%)，在微波衰減≥45 dB時，所有樣品的減少可能是因電子未被低功率完全激發而引起的(24.0% ～ 58.1%)。參照略高于飽和曲線法微波衰減值，并且兼顧各類型土壤，本研究確立27 dB左右(25 ～ 30 dB)為較適宜值。

與微波功率曲線法相比，相鄰微波衰減6 dB信號比較法耗時較少(2 ～ 5 min)，操作步驟更容易。但是，由于該方法需要6 dB的步長，導致其判定結果范圍跨度較大。實際測試過程中，建議以飽和功率曲線法為主，以相鄰微波衰減6 dB信號比較法為補充，兩者相結合的方式選用。

2.3.3 微波功率的影響 有研究表明，土壤中有機質、過渡金屬與有機污染物可發生相互作用，并通過電子的傳遞與轉移生成穩定的EPFRs[6，21，32]。本研究結果顯示，土壤樣品S5中Fe2O3、Cu、Zn等含量都較高，其譜儀的飽和曲線法與微波衰減法均對應了最小飽和衰減值，意味著檢測中最易功率飽和。而其他土壤樣品中某一個項目含量高并不會顯著影響EPFRs微波衰減的優選值(表3)，這一現象將在以后更多的樣品檢測中進行進一步驗證。

由于不同未配對電子基團對微波功率的響應存在不同，調節微波功率常被作為區分自由基的有效方法之一。從圖5可知，樣品S1中除存在2.003 3峰外，高場還有另一EPFRs(=2.000 4)信號，并且兩者對微波功率的響應完全不同。S2 ～ S8樣品也存在相似的情況，當微波衰減至大于約16 dB時，這一峰才會被檢測到，繼續增大衰減，直至33 dB，高、低場兩個因子的自由基可較明顯同時出峰，并且當微波衰減≥45 dB時，高場自由基信號強度增加幅度明顯強于低場信號。研究報道中，根據因子可判斷低場峰來源于碳中心與含氧基團自由基或碳氧混合中心自由基[6，22]，高場峰卻為另一順磁信號。可見，適宜的微波功率是確保樣品自由基類型判定的可靠定性與自旋濃度定量的準確性的關鍵前提。

(S1 ～ S8圖中，柱上方百分數為理論計算自旋濃度是實測值的相對標準偏差；0% 表示以此微波條件實際測定值為基準計算其他微波設置參數的理論值；百分數值前符號“+”“–”分別表示實測值較理論值的高與低)

圖5 土壤S1中 EPFRs在不同微波衰減下EPR圖譜

2.4 調制幅度與頻率的選擇

2.4.1 調制幅度 隨著調制幅度從1 G增加至9 G，EPR圖譜的信號強度也會相同倍數地增大。當調制幅度等于線寬時，記錄信號最大，如果其值繼續增大，EPR信號高度就開始下降，而且線寬被增寬，波譜圖出現畸變[19](圖6)。本研究樣品S1 ～ S8的EPFRs信號中，較大(2.003 0 ～ 2.003 5)峰的線寬為3.28 ～ 6.91 G，另一高場峰(=2.000 4)為0.90 ～ 1.45 G，應視研究需求而選擇合適的調制幅度。若只關注前一峰，則應選擇小于3.28 G即可，若需兼顧較窄峰，則可選擇1 G (表2)。文獻報道[2,4,26,32]，調制幅度1、2、4、5 G均有被采用，為了增強信號較弱實際樣品的強度，可適當調高調制幅度，為了兼顧靈敏度與分辨率，調制幅度的設置值應小于或等于峰–峰線寬[18]。

圖6 不同調制幅度的響應

2.4.2 調制頻率 由圖7顯示，分別設置10、20、50、100 kHz檢測樣品S1 ～ S8中EPFRs，其響應并無明顯差異，建議選用X波段儀器默認調制頻率值100 kHz即可。但是對于特別細的EPR信號，調制頻率應調小，才能將所有的圖譜峰都分辨出來。

2.5 掃描時間、次數的選擇

EPR圖譜掃描速度應盡量設置在1 ～ 2 G/s范圍內，即在擴大掃描寬度時，應相應地增加掃描時間，這樣才能控制因子在誤差允許范圍內。本文中掃描寬度設置為100 G，結合實際峰與測試效率，掃描時間可略調整至40 s左右。

圖7 不同調制頻率的響應

圖8 不同掃描次數的響應

2.6 增益值的選擇

增益值(receive gain)是信號接收端對信號的放大系數，單位dB，實質為放大倍數，其值越大譜線信號與噪聲強度均被放大，過大會出現譜峰被切削的情況，應適當調低此值。對S1 ～ S8土壤樣品EPFRs對不同增益值的響應進行測試，結果見圖9。從圖中可知，3、15、45、60 dB對其峰的響應并沒有明顯差異。但是，為了兼顧樣品信號強度與峰型，一般不選用譜儀可設置的最大值60 dB，而選用稍低值，本研究中選用42 dB。

圖9 不同增益值的響應

2.7 測試溫度的選擇

低溫條件下譜儀的靈敏度會變高，從而獲得更強的信號強度，但為了節約資源與成本，本研究樣品中EPFRs在常溫條件下進行測試。在具備條件時，可在低溫條件下測試，應注意其頻率與中心磁場的變化。隨著溫度降至100 K，微波頻率下降至約為9.4 GHz，相對應中心磁場在3 350 G左右。

2.8 自旋濃度定量參數的選擇

按照儀器操作步驟[29]，本文采用譜儀可對已讀取微波衰減至33 dB時諧振腔的品質因子Q時EPFRs峰進行定量。在儀器安裝的軟件xepr中點擊定量EPR，選中峰的起止范圍并進行二次積分，對應填入樣品管內徑4 mm、諧振腔的中心距離62.5 mm、樣品高度15 mm、電子自旋數1/2，即可自動計算并顯示EPFRs的電子自旋數，再與質量之比即為自旋質量濃度。本研究中儀器采用絕對定量法，其他設備可能會需選用比較法，具體方法可參見文獻[28]。

3 數據質量控制與檢出限

土壤EPFRs檢測過程中，監測標準樣品BDPA的值可對自由基的定性進行質量控制。參照儀器操作手冊[29]設置檢測參數，BDPA的值分別為2.002 61、2.002 60、2.002 54，均在標準物質范圍2.002 22 ～ 2.002 87內，其圖譜見圖10。由此可判定儀器檢測樣品中自由基的因子準確、可靠。

圖10 BDPA 標準樣品圖譜

圖11 丙氨酸片標準樣品圖譜

當需對土壤EPFRs進行定量檢測時，丙氨酸片可作為自由基電子自旋數數據質量的評估。在測試過程中，參照廠商證書參數檢測丙氨酸片標樣，結果見圖11。3次電子自旋數定量值分別為1.43×1017、1.39×1017、1.40×1017，與證書標準參考值(1.43×1017)比，其定量結果在允許波動范圍±10% 內。可見，譜儀檢測樣品中自由基自旋濃度準確、可靠。

據譜儀廠商提供，儀器最小檢出絕對自旋數為1×109spins/G。實際樣品的檢出限應對應樣品響應信號為基線信號的3倍(/=3)時的濃度值。

4 結論

土壤中EPFRs的EPR譜儀測試參數可設置為：中心磁場約3 502 G、微波頻率9.82 GHz、調制幅度1 G、掃描寬度100 G、掃描時間40 s等。微波功率飽和曲線法確立微波功率的參考范圍更窄，微波衰減相鄰6 dB信號比較法耗時少，建議以前者為主，后者為補充，根據實際情況兩者結合選用。本研究的土壤EPFRs低場峰(=2.003 0 ～ 2.003 5)較優的微波衰減值為27 dB左右(25 ～ 30 dB)，實驗中應根據實際樣品信號強弱來決定選擇較大或較小值。然而，另一高場峰(=2.000 4)在高微波衰減值信號更佳。本文優選方法及適宜值可為土壤與環境固態樣品EPFRs的準確測定提供重要參考。

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Study on Method of Environmental Persistent Free Radicals in Soils by Electron Paramagnetic Resonance Spectroscopy

JIANG Qian, TANG Haoye, LIU Yun, LU Guoxing, NI Jun, TU Yonghui, FAN Qiaojun, GONG Hua, MA Zuohao

(CASKey Laboratory of Soil Environment and Pollution Remediation, Institute of Soil Science, Chinese Academy of Sciences, Nanjing 210008, China)

A method for the determination of environmental persistent free radicals (EPFRs) in soil by electron paramagnetic/spin resonance spectroscopy (EPR/ESR) was established. In this paper, the central magnetic field, microwave power and modulation amplitude of the EPR spectrometer (x-band continuous wave) are tested and optimized. Based on the measured microwave frequency ν (9.82 GHz) and thefactor of the EPFRs, the central magnetic field of the spectrometer can be set to about 3 502 G. The microwave power saturation curve method and the microwave attenuation comparison method are used to optimize the microwave power. The two methods have their advantages and disadvantages, should be applied complementarily by both. Compared with 27 dB, microwave attenuation is set to ≤15 dB, and the peak (=2.003 0 ～ 2.003 5) is suppressed by more or less due to power saturation. Therefore, about 27 dB or 25-30 dB is considered to be the optimal microwave attenuation value of this peak. However, the response of the other peak of higher magnetic field (=2.000 4) is different, and the peak intensity is stronger at the higher attenuation value. In addition, the modulation amplitude should be smaller than the least peak-peak width (3.28 G), and 1 G is suitable if the narrower peak (1 G) is also studied. This method can be applied to the determination of EPFRs in soils and environmental solid samples, and it can ensure the accuracy offactor, the resolution and the reliability of superfine splitting of EPR spectra.

Electron paramagnetic resonance; Electron spin resonance; Spectroscopy; Environment persistent free radicals; Soils

O482.53；X53；S1

A

10.13758/j.cnki.tr.2023.02.019

蔣倩, 唐昊冶, 劉云, 等. 基于電子順磁共振波譜法的土壤環境持久性自由基的檢測方法研究. 土壤, 2023, 55(2): 379–389.

國家重點研發計劃項目（2020YFC1807200，2018YFC1803100）資助。

蔣倩（1980—），女，貴州思南人，博士，高級工程師，主要從事儀器分析方法與功能的研發。E-mail: qjiang@issas.ac.cn