艾煙和香煙對APP/PS-1小鼠海馬核苷酸結合寡聚結構域樣受體蛋白3炎性小體的影響探討

吳嘉威 王昊 劉雅潔 和蕊 何夢如 趙百孝

近年來,相關研究發現腦內慢性炎癥反應是阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)發病的一個重要因素[1]。小膠質細胞在β淀粉樣蛋白(amyloid β-protein,Aβ)觸發作用下,激活核苷酸結合寡聚結構域樣受體蛋白3(NOD-like receptor protein 3,NLRP3)炎性小體,通過相關通路進一步誘導產生致炎性細胞因子和神經元毒性物質,最終導致神經元的損傷、死亡,加重AD病癥[2-3]。因此從緩解腦內慢性炎癥角度出發,探究延緩AD進程迫在眉睫。

艾灸是非藥物療法組成之一,因其簡便、有效應用于包括AD在內的諸多疾病研究[4-6]。其中艾燃燒生成物作為艾灸起效的機理之一[7],艾煙是艾燃燒生成物的主要成分,發揮著不可缺少的作用并引起人們的關注與探究[8-9]。本課題組前期研究提示艾煙在AD方面具有調節炎性因子,延緩AD病程等作用[10-12],但艾煙對于NLRP3炎性小體的作用尚未明確。艾煙的煙霧氣體在空氣中形成顆粒分子擴散,其形式在一定程度上與香煙類似,同時亦有報道說明香煙與AD密切相關,故本實驗選用香煙煙霧作為對比,探究其二者對于NLRP3炎性小體的影響。

本實驗擬以艾煙作為干預方式,與香煙進行對比,通過觀察艾煙與香煙對NLRP3、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1(cysteinyl aspartate specific proteinas E-1, Caspas E-1)、Toll樣受體4蛋白(toll-like receptor 4, TLR4)、白細胞介素-1β(interleukin-1β, IL-1β)等炎性小體相關指標的影響,從神經炎癥角度分析艾煙對AD的部分機制,同時驗證香煙與AD的關系。

1 材料與方法

1.1動物分組

6月齡APP/PS-1雄性小鼠36只,體質量為(30±2)g,購自北京唯尚立拓生物科技有限公司,許可證號:SCXK(京)2016-0009。將小鼠分為模型組、香煙組、艾煙組,C57BL/6小鼠作為空白對照組,每組12只。飼養環境溫度維持在(22± 2) ℃,相對濕度(55±5)%,保持光照(8:00～20:00)和黑暗(20:00～次日8:00)交替。

1.2干預情況

艾煙組:每天抓取老鼠,固定于小鼠固定器(自制)中,然后將固定器放入玻璃柜中,玻璃柜內放置調試好的激光粉塵測試儀。點燃艾條,利用勻速空氣動力扇使煙霧在玻璃缸中彌漫,每隔3分鐘用粉塵測試儀測試其濃度,使玻璃缸中的艾煙濃度控制在5～15 mg/m3之間,每日艾煙干預1次,共20分鐘,每周6次,共計8周。香煙組:點燃香煙,干預方法同艾煙組。模型組、空白組:每天抓取老鼠,固定于小鼠固定器中,固定時間同上。

1.3主要試劑

重組Anti-NLRP3抗體、Anti-Caspase-1抗體、Anti-TLR4抗體、Anti-IL-1β抗體(上海艾博抗貿易有限公司);Anti-β-Actin抗體(南京巴傲得生物科技有限公司);BCA蛋白定量試劑盒、2 mg/mL BSA標準品、5×還原樣品緩沖液、10×Tris-GlycinE-SDS電泳緩沖液、考馬斯亮藍染色液、10×TBST pH 8.0、中性樹膠封片劑(北京索萊寶科技有限公司);蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑(上海羅氏制藥有限公司);通用型試劑盒、DAB顯色試劑盒、抗原修復液(北京中杉金橋生物技術有限公司);組織學切片石蠟(德國萊卡Leica);雙氧水、無水乙醇、二甲苯(國藥集團化學試劑有限公司)。

1.4主要儀器

定制普通清艾條(8 mm×150 mm,湖北蘄春李時珍醫藥集團);市售香煙(雙喜牌,焦油含量11 mg/支);玻璃缸(80 cm×80 cm×60 cm,自制,玻璃壁上設有硬幣大小的圓孔);光散射式數字粉塵測試儀(北京賓達綠創科技有限公司);Morris水迷宮(北京豪沃生物科技有限公司);普通光學顯微鏡;低溫冷凍離心機(賽默飛世爾科技有限公司);Mini P-4電泳槽、濕轉電泳槽、電泳儀、半干槽(美國Bio-Rad伯樂);病理切片機(RM2235,德國徠卡);包埋機(JB-P7,武漢俊杰電子有限公司);烤片機(DB-B2,常州國華電器有限公司)。

1.5Morris水迷宮空間探索實驗

在末次干預后,每組隨機選取6只進行水迷宮行為學實驗。水迷宮為直徑120 cm的塑料圓形水池(加水深度40 cm),內有恒溫加熱裝置,水溫保持為(22±2)℃,平臺直徑為10 cm,訓練5天,第6天進行空間探索實驗,水迷宮系統自動記錄空間探索實驗中小鼠游泳軌跡、穿越平臺次數和平臺區域游泳時間。

1.6標本采集與檢測方法

1.6.1 標本采集 末次干預后,禁食不禁水12 小時,小鼠用2%戊巴比妥鈉溶液按照45 mg/kg的藥量進行腹腔麻醉注射后取材。每組隨機選取6只小鼠,在冰臺上快速剝離海馬組織待檢。其余小鼠分別用0.1 mol/L磷酸緩沖鹽溶與4%濃度的多聚甲醛溶液進行心臟灌注后取出腦組織,稱重放入4 %多聚甲醛溶液中,待切片觀察。

1.6.2 Western blot法 裂解緩沖液提取小鼠海馬總蛋白;根據BCA法測定各組蛋白濃度,依據蛋白濃度進行SDS-PAGE電泳及轉膜,在封閉后加入一抗4 ℃靜置過夜;而后與二抗雜交、化學發光顯色,經過曝光、顯影、定影、掃描后分析目標帶的灰度值。實驗以β-actin(1∶1000)作為內參照物。

1.6.3 免疫組化 石蠟切片抗原修復,滴加山羊血清、一抗工作液4 ℃過夜;加入二抗工作液隨后依次進行DAB、蘇木精染色,封化后水洗、脫水封片;選取切片成像圖應用ImageJ軟件計算累積光密度值(integrated optical density, IOD)。

1.7統計學分析

采用SPSS 20.0軟件進行統計分析,各組水迷宮穿越平臺次數和平臺區域游泳時間、NLRP3、Caspase-1、TLR4、IL-1β數據均符合正態分布且滿足方差齊性,使用One Way ANOVA單因素方差分析,組間對比采用LSD法進行兩兩比較,實驗數據結果以均值±標準誤(mean±S.E.M.)表示。當統計結果P<0.05 時認為有統計學差異。

2 結果

2.1Morris水迷宮空間探索實驗評價各組小鼠學習記憶功能

各組小鼠水迷宮游泳軌跡圖及軌跡熱圖如圖1所示。空白組小鼠軌跡圖主要集中在目標平臺象限,趨向性明顯;與空白組相比,模型組小鼠軌跡軌跡較為散亂,趨向性不明確;與模型組相比,香煙組小鼠軌跡散亂分布,且在非目標平臺象限活動明顯;艾煙組小鼠軌跡在各象限分布相對均勻,在目標象限有一定的趨向性,在目標平臺活動增加。

圖1 各組小鼠水迷宮游泳軌跡圖及軌跡熱圖

各組小鼠水迷宮穿越平臺次數和平臺區域游泳時間如表1所示。與空白組相比,模型組小鼠穿越平臺次數和在平臺區域游泳時間明顯降低(P<0.05);與模型組相比,香煙組小鼠穿越平臺次數和在平臺區域游泳時間沒有明顯變化(P>0.05),艾煙組小鼠穿越平臺次數和在平臺區域游泳時間明顯增多(P<0.05);與香煙組相比,艾煙組小鼠穿越平臺次數和在平臺區域游泳時間明顯增多(P<0.05)。

表1 各組小鼠水迷宮穿越平臺次數和平臺區域游泳時間(mean±S.E.M.)

2.2Western blot檢測各組小鼠NLRP3、Caspase-1、TLR4、IL-1β結果

與空白組相比,模型組小鼠的NLRP3、Caspase-1蛋白含量顯著升高(P<0.05);與模型組相對比,香煙組小鼠的NLRP3、Caspase-1含量顯著升高(P<0.05),艾煙組小鼠顯著降低(P<0.05)。艾煙組小鼠相較于香煙組NLRP3、Caspase-1含量顯著降低(P<0.05),相較于空白組顯著升高(P<0.05),見圖2、表2。

圖2 各組小鼠海馬NLRP3、Caspase-1、TLR4、IL-1β蛋白表達條帶

表2 各組小鼠海馬NLRP3、Caspase-1的相對表達量比較(mean±S.E.M.)

與空白組相比,模型組小鼠的TLR4、IL-1β蛋白含量顯著升高(P<0.05);與模型組相對比,香煙組小鼠的TLR4含量顯著升高(P<0.05),IL-1β蛋白含量變化不顯著(P>0.05);艾煙組小鼠TLR4、IL-1β蛋白含量顯著降低(P<0.05)。艾煙組小鼠相較于香煙組TLR4、IL-1β含量顯著降低(P<0.05),相較于空白組顯著升高(P<0.05),見表3。

2.3免疫組化檢測各組小鼠NLRP3、Caspase-1、TLR4、IL-1β表達的IOD值結果

與空白組相比,模型組IOD值均顯著升高(P<0.05);與模型組相比,香煙組IOD值變化均不顯著(P>0.05),艾煙組數值顯著降低(P<0.05)。艾煙組小鼠相較于香煙組IOD值均顯著降低(P<0.05),相較于空白組顯著升高(P<0.05),見圖3、表4。

注:a 空白組;b 模型組;c 香煙組; d 艾煙組。

表4 各組小鼠海馬NLRP3、Caspase-1表達的IOD值比較(mean±S.E.M.)

與空白組相比,模型組IOD值顯著升高(P<0.05);與模型組相比,香煙組IOD值變化不顯著(P>0.05),艾煙組數值顯著降低(P<0.05)。艾煙組小鼠的IOD值相較于香煙組IOD值顯著降低(P<0.05),艾煙組TLR4表達的IOD值相較于空白組顯著升高(P<0.05),IL-1β的IOD值相較于空白組數值變化不顯著,見圖4、表5。

注:a 空白組;b 模型組;c 香煙組; d 艾煙組。

表5 各組小鼠海馬TLR4、IL-1β表達的IOD值比較(mean±S.E.M.)

3 討論

AD是一種以記憶障礙、語言功能和其他認知能力衰退為主要癥狀的慢性神經系統退行性疾病[13-14]。援引2021年《世界阿爾茨海默病報告》數據,目前全球有超過5500萬人被診斷為阿爾茨海默病[15-16]。治療及護理AD患者給家庭和社會帶來極大的生活、經濟負擔,總體形勢不容小覷。AD的病理特征為神經細胞內出現淀粉樣斑塊(senile plaques,SP),由Aβ構成、神經元纖維纏結(neurofibrillary tangles,NFTs)和神經元丟失等[13,17]。雙重轉基因APP/PS-1小鼠模型能促進Aβ沉淀、SP病理等過程,可以很好的模擬AD的早期記憶功能損傷等臨床特征而被大量用于AD實驗研究[18]。

NLRP3炎性小體激活與AD息息相關。NLRP3炎性小體是小膠質細胞等具有先天免疫力細胞胞漿內模式識別受體參與組裝的多聚體蛋白復合物,可被細胞感染和應激或組織損傷等因素激活[19]。NLRP3炎性小體激活需要兩個信號(1)通過啟動TLR4促進核因子κB(nuclear factor kappa B,NF-κB)進行轉錄;(2)同時在Aβ等因素刺激下促使Caspase-1活化,介導下游炎癥級聯反應如IL-1β等炎癥因子的釋放,產生或加重腦內慢性炎癥[20-22]。TLR4受體在中樞神經系統中主要表達于小膠質細胞,能夠識別并結合相應的病原相關分子模式從而引發機體的固有免疫反應,在神經炎癥的級聯反應中占據重要位置[23-24]。Caspase-1主要參與細胞因子介導參與的炎癥反應,在微生物感染或細胞內危險信號存在時,Caspase-1可通過與炎性體結合而發生激活,從而加工IL-1β前體和IL-18前體等炎癥因子使其成熟并釋放IL-1β等,在炎癥反應中起著核心調控作用[25]。

傳統中醫藥在AD小膠質細胞神經炎癥領域頗有建樹[26],而艾灸等非藥物療法因其副作用小、簡便等優勢備受關注。相關研究表明艾灸能夠有效調節NLRP3炎性小體在體內的表達,起到積極的治療作用[27-29]。承淡安指出“艾灸的特殊作用,不僅在于熱,更在于其特有的芳香氣味”[30]。此“芳香氣味”除了艾材自身的氣息外,艾煙也是其重要存在形式。本課題組前期研究發現,5～15 mg/m3的艾煙濃度干預能夠在一定程度上改善AD動物模型小鼠腦組織的氧化應激狀態,同時可以調整細胞因子偏移、調控炎性因子,可能與NLRP3炎性小體所激活的先前條件相關。

艾煙做為顆粒煙霧氣體與香煙形態相似,同時當今對于艾煙的安全性評價言人人殊,更容易將艾煙與香煙混為一談。有研究表明吸嗅香煙與癡呆、認知障礙密切相關,吸嗅香煙在給吸煙者本身造成身體危害的同時,其形成的環境香煙煙霧亦對被動吸煙者造成影響[31-33]。基于此,本實驗將艾煙與香煙對APP/PS-1小鼠海馬NLRP3炎性小體表達情況進行對比分析,在一定程度闡明艾煙的安全性。本實驗Morris水迷宮空間探索實驗中結果顯示,與模型組相比,香煙組小鼠的軌跡散亂分布,且在非目標平臺象限活動明顯,穿越平臺次數和在平臺區域游泳時間沒有明顯變化,表明香煙加重小鼠學習、認知功能障礙;結合本WB實驗結果,香煙組小鼠的NLRP3、Caspase-1、TLR4蛋白含量顯著升高,提示香煙促進了NLRP3炎性小體的激活與表達,IL-1β雖然降低但沒有顯著性,有可能與實驗檢測過程中蛋白降解相關。相關研究發現在香煙暴露下會增加路易斯大鼠大腦中TNF-β、IL-1β等炎癥因子的釋放[34],可以在一定程度上彌補本實驗的不足。同時免疫組化中香煙組小鼠海馬細胞排列紊亂,神經元壞死產生的空隙明顯增多,這表明香煙加劇了AD慢性炎癥。上述通過觀察艾煙與香煙對于APP/PS-1小鼠海馬NLRP3炎性小體作用情況可以看出,相較于香煙加重小鼠腦內的慢行炎癥而言,艾煙干預能夠抑制NLRP3炎性小體,具有一定的治療作用和安全性。

但于AD而言,艾煙的作用機理仍需要深入探究。隨著艾絨的燃燒,易揮發成分及其中難揮發成分逐漸通過熱裂解從固態、液態轉化為氣態,以艾煙的形式擴散,通過呼吸道吸入、皮膚吸收等多個途徑進入體循環發揮綜合作用;而艾煙中獨特的芳香氣味又與芳香療法密切相關,通過嗅覺通路作用與中樞系統發揮調控作用[35-36]。有研究表明,艾煙能夠改善SAMP8小鼠嗅球形態及嗅球、海馬內谷氨酸等神經遞質的釋放[12,37],緩解AD病程。結合本實驗而言,艾煙干預能夠抑制TLR4啟動激活而抑制NLRP3炎性小體的表達,其作用途徑有可能是通過嗅覺通路激活中樞系統發揮作用,但并不排除艾煙通過其他因素發揮作用。本文從神經炎癥角度探究艾煙與香煙對APP/PS1模型小鼠海馬NLRP3炎性小體的影響,具有創新性。

綜上,本研究結果提示艾煙能夠抑制APP/PS1模型小鼠海馬NLRP3炎性小體的表達,抑制炎癥反應,可能與AD神經炎癥發病機制相關;香煙增加APP/PS1模型小鼠海馬NLRP3炎性小體的表達,加劇炎癥反應。