陜產附子泡膽工藝的改進和優化研究

李凡 張景霞 王衛鋒 李莎莎 毛阿娟 李雅娟 陳曦 李芳

附子為毛茛科植物烏頭AconitumcarmichaeliiDebx.的子根的加工品,始載于《神農本草經》,味辛,甘,性大熱,有毒。具有回陽救逆、補火助陽、散寒止痛之功[1]。附子為臨床常用中藥之一,陜西漢中是附子的原產區和主產區之一,種植歷史悠久,產量大,并于 2009年獲得國家地理標志產品保護。

附子作為毒性藥材的代表,其炮制研究引起了廣泛關注。自1963年起,附子在每版藥典均有收載,多以炮制品入藥,現代附子飲片市場主流為黑順片等,現代部頒及藥典標準方中運用的也有黑順片等規格。法定標準中雖然對附子的炮制方法進行了規定,以黑順片為例,炮制過程需經過泡膽、煮、浸漂、染色、蒸、曬(烘干)等環節,但其炮制工藝仍停留在傳統的經驗控制水平,沒有明確的工藝參數,不同的操作者甚至同一操作者不同批次的加工,都無法保障黑順片炮制加工工藝的穩定性及均一性,從而影響飲片的質量[2-3]。

泡膽是黑順片產地加工炮制的關鍵環節之一,膽巴的主要目的是為了防止附子腐爛,利于貯存。膽巴稱鹵水,是制鹽工業的副產物,是老膽水經蒸發濃縮而凝固成型,其主要成分以氯化鈣、氯化鎂為主,能凝固蛋白質而具有防腐作用,對胃、皮膚、食管也具有腐蝕作用,而鎂離子被吸收后能抑制心血管和神經系統,對人具有毒性[4],且膽巴無法定標準。

本團隊前期曾去陜西漢中實地考察,當地農戶和企業有用氯化鈣進行泡膽的操作。課題組采集了產自漢中4個縣(區)的15批泥附子樣品,采用超高效液相色譜法同時對樣品中6種酯型生物堿的含量進行測定[5]。

故本文在前期研究基礎上擬對有藥典標準的氯化鈣代替傳統膽巴作為附子防腐、加工和炮制的輔料的可能性和科學性進行探討,并在單因素的基礎上,以效/毒為指標,以三因素(浸泡時間、氯化鈣濃度、料液比)三水平,采用Box-Behnken響應面設計對陜產附子的浸泡工藝進行優化。

1 材料與方法

1.1實驗材料

附子(采于陜西漢中),樣品經陜西省中醫藥研究院王衛鋒教授鑒定均為毛茛科植物烏頭(AconitumcarmichaeliiDebx.)的子根; 膽巴(四川省蓬萊鹽化有限公司生產),氯化鈣(食品級,山東海化股份有限公司氯化鈣廠)。

1.2實驗試劑

對照品:苯甲酰新烏頭原堿,批號:CHB180310,質量分數≥98%;苯甲酰烏頭原堿,批號:CHB180309,質量分數≥98%;苯甲酰次烏頭原堿,批號:CHB180307質量分數≥98%;烏頭堿,批號:CHB180408,質量分數≥98%;新烏頭堿,批號:CHB180311質量分數≥98%;次烏頭堿,批號:CHB180524質量分數≥98%,均購自克洛瑪科技有限公司。

試劑:乙腈為HPLC 級試劑(美國賽默飛公司),色譜用水(娃哈哈純凈水);其它試劑均為分析純(國藥集團)。

1.3實驗儀器

Waters Acquity H-CLASS型超高效液相色譜儀(UPLC EmpowerTM3 色譜工作站、PDA 檢測器)、ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(2.1 mm×50 mm,1.7 μm)、電子分析天平(型號:BP211D型,德國賽多利斯)、超聲波清洗機(型號:KH-300DE,昆山禾創超聲儀器有限公司)、紅外快速干燥箱(型號:WS70-1,上海市吳淞五金廠制造)、旋轉蒸發儀(型號:RE-52AA,上海亞榮生化儀器廠)、循環水式多用真空泵(型號:SHB-III,鄭州長城科工貿)、臺式離心機(型號:TGL-16G,上海安亭科學)、電子調溫電熱套(型號:98-1-B,天津泰斯特)

1.4附子生物堿類成分的含量測定

1.4.1 色譜條件與系統適用性實驗 色譜柱為Waters ACQYITYC18柱(50 mm×2.1 mm,1.7 μm);乙腈為流動相A,0.04 mol/L乙酸銨溶液(氨水調pH=10)為流動相B,(A∶B,V∶V)0～5分鐘,26% A;5～15分鐘,26%～39% A;15～20分鐘,39%～45% A;20～25分鐘,45%～39% A;25～30分鐘,39%-26% A;流速:0.3 mL/分鐘;柱溫:25 ℃;對照品進樣量:2 μL;供試品進樣體積:1 μL;檢測波長為235 nm[6]。

1.4.2 溶液的制備 (1)對照品溶液的制備:取苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、新烏頭堿、烏頭堿、次烏頭堿對照品適量,精密稱量,加異丙醇—二氯甲烷(1∶1)混合溶液,各質量濃度為:苯甲酰新烏頭原堿46.36 μg/mL、苯甲酰烏頭原堿16.77 μg/mL、苯甲酰次烏頭原堿32.105 mg/mL、新烏頭堿138.23 μg/mL、烏頭堿92.4 μg/mL和次烏頭堿130.82 μg/mL。(2)供試品溶液的制備:取各個泡膽炮制環節的附子樣品,洗凈、切片后干燥,粉碎制備成粉末。取取各樣品粉末(過三號篩)約2 g,精密稱定,置于錐形瓶中,加入氨試液3 mL,精密加入異丙醇-乙酸乙酯(1∶1)混合溶液50 mL,稱重,超聲處理(功率300 W,頻率40 HZ,水溫在25 ℃以下)30分鐘,放冷,再稱重,用異丙醇-乙酸乙酯(1∶1)混合溶液補足重量,搖勻,濾過,精密量取濾液25 mL,40 ℃以下減壓回收溶劑至干,精密加入0.05 %鹽酸甲醇溶液3 mL復溶解殘渣,過 0.22 μm濾膜,取濾液,即得[7]。

1.5泡膽工藝的改進

1.5.1 膽巴溶液的配制 取膽巴加水配制成濃度為20%的膽巴溶液[8]。

1.5.2 氯化鈣溶液的配制 取氯化鈣加水配制成濃度為20%的氯化鈣溶液。

1.5.3 不同浸泡時間考察 取附子約4 kg,除去須根,洗凈。分別取2 kg,以1∶4的料液比浸入配制好的膽巴水溶液和氯化鈣溶液中。浸泡時間均設定為:0天、1天、3天、5天、7天、9天、11天、13天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、22天、25天、30天,分別浸泡不同時間后取出,縱切成厚約0.2～0.5 cm的切片,在60°C下烘干,測定不同浸泡時間附子生物堿含量差別。

2 結果

2.1附子生物堿類成分的含量測定

超高效液相色譜法(UPLC)分別測定膽巴浸泡與氯化鈣浸泡后雙酯型(以烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿總量計)與單酯型(以苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭堿計)生物堿總量,測定結果見表1。附子經不同時間膽巴溶液與氯化鈣溶液浸泡,雙酯型生物堿總含量呈下降趨勢。單酯型生物堿總量在浸泡第7天左右總量升高,在浸泡20天左右單酯型生物堿總量下降,處于平穩。實驗結果得出,附子經過膽巴溶液與氯化鈣溶液浸泡生物堿含量變化大體一致,產地加工可用氯化鈣溶液浸泡附子代替膽巴溶液浸泡。結果見圖1～2。

圖1 不同浸泡時間附子中雙酯型生物堿總量變化趨勢圖

圖2 不同浸泡時間附子中單酯型生物堿總量變化趨勢圖

2.2改進后的泡膽工藝參數的優選

2.2.1 單因素試驗對泡膽初加工的考察 參考文獻[8-10],在單因素試驗中以效/毒值(苯甲酰新烏頭原堿含量/雙酯型生物堿總含量)為指標,可較為全面的反映附子在氯化鈣水溶液中的浸泡過程,選取浸泡時間、氯化鈣濃度、料液比為因素進行試驗。

2.2.2 浸泡時間對效/毒的影響 取附子,除須根,洗凈,稱取5份,每份約150 g,按1∶4的料液比加入25%的氯化鈣溶液,分別浸泡6、12、18、24、30天,切片,60°C下烘干。按本章“2.2.2”項下制備供試品,考察不同浸泡時間對效/毒的影響。可知,效/毒隨著浸泡時間的增加,在18天時含量出現微下降。故選擇浸泡時間為18天,結果見表2。

表2 浸泡時間對附子效/毒的影響

2.2.3 料液比對效/毒的影響 取附子,除須根,洗凈,稱取5份,每份約150 g,分別按料液比為1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6加入25 %的氯化鈣溶液,浸泡18天,切片,60°C烘干。按本章“2.2.2”項下制備供試品,考察料液比對效/毒的影響。可知,效/毒隨料液比的增加趨勢趨于平緩,故選擇料液比為1∶4,結果見表3。

表3 料液比對附子效/毒的影響

2.2.4 氯化鈣濃度對效/毒的影響 取附子,除須根,洗凈,稱取5份,每份約150 g,按料液比1∶4分別加入濃度為10 %、15 %、20 %、25 %、30 %的氯化鈣溶液,浸泡18天,切片、60°C下烘干。按本章“2.2.2”項下制備供試品,考察氯化鈣用量對效/毒的影響。可知,隨著氯化鈣濃度的增加,效/毒在25 %時最高。因此,選用25%的氯化鈣溶液,結果見表4。

表4 氯化鈣濃度對附子效/毒的影響

2.2.5 Box-Behnken響應面法優選初加工工藝條件 在單因素試驗基礎上,采用中心組合設計,設計響應面試驗,根據中心組合實驗設計原理,用浸泡時間(X1)、料液比(X2)、氯化鈣濃度(X3)為因素,以效/毒為響應值,結果見表5。

表5 響應面優化試驗因素水平表

2.3響應面實驗設計與結果

2.3.1 響應面分析實驗 通過浸泡時間(X1)、料液比(X2)、氯化鈣濃度(X3)進行綜合響應面分析,考察效/毒,結果見表6。

表6 響應面分析實驗設計與結果

2.3.2 二次響應面回歸模型建立 利用Design-Expert 10.0.4 軟件,設計出不同的炮制工藝進行實驗,以綜合評分Y為響應值,分析得到回歸方程為:

Y=0.077+5.975E-003X1+1.382E-003X2-2.156

-003X3+1.692E-003X1X2+8.962E-003X1X3

+5.960E-003X2X3-0.017X12-7.192E-003X22

-3.846E-003X32,相關系數R2=0.9077。

2.3.3 二次響應面回歸模型方差分析 從表7可以看出,模型的F=7.65,P=0.0069<0.01,表明此模型具有顯著性,構建有效。失擬項P=7.78>0.05,是不顯著的,即試驗數據和模型預測值相符合,模型構建合理。在本實驗模型中,數據R2=0.9077,AdjR2=0.78915,并且自變量和響應值之間有相互的對應關系,說明回歸方程能夠真實的模擬響應曲面的情況,響應值的變化有78.9%的概率與本實驗考察的三因素變化有關。R2-AdjR2=0.2,說明實驗中存在的誤差對實驗結果影響不大。Adeq precisior=8.349,說明實驗中存在的誤差對實驗結果影響也很小,信噪比很大,同時根據圖4可以看出,預測值與實際值較近,本實驗構建的模型能夠預測效/毒值,由實驗P 值可知,本實驗三個因素對效/毒的影響大小不同,順序為X1>X3>X2,交互影響大小順序為X1X3>X2X3>X1X2。其中X1、X1X3、X12、X22對綜合評分較大(P<0.05),X2、X3、X1X2、X2X3、X32影響較小(P>0.05)。

圖4 二次響應面回歸構建的模型預測效/毒值與實際效/毒值比較

表7 響應面方差分析

2.3.4 響應面曲面分析 響應面坡度越陡,表示兩因素交互作用越明顯。等高線的形狀可反映出交互效應的強弱大小,越密集,效應越強。橢圓形表示兩因素交互作用顯著,而圓形則相反。由圖5、6、7可看出,AC和BC的等高線形成的橢圓形長軸和短軸之比較大,說明AC和BC之間交互影響比AB之間交互影響顯著。由圖8可知,隨著浸泡時間的增加,效/毒值也在增加,曲面變得陡峭,而料液比曲面相對平緩,說明浸泡時間影響較大。由圖9可知,隨著浸泡時間的增加,效/毒值先升高再降低,曲面坡度較陡,而氯化鈣濃度的增加,效/毒值曲面較平坦,相比來說浸泡時間的影響較大。由圖10可知,在氯化鈣濃度和料液比的增加,曲面走向變的平緩,根據3D曲面圖,得出浸泡時間和料液比,浸泡時間和氯化鈣濃度的交互作用大于料液比和氯化鈣的交互作用。經軟件數據分析,響應面最優工藝為:X1浸泡時間為19.2天、X2料液比為1∶4.15、X3氯化鈣濃度為25.37%。

圖5 浸泡時間與料液比對附子效/毒的交互作用影響3D圖

圖6 浸泡時間與氯化鈣濃度對附子效/毒的交互作用影響3D圖

圖7 料液比與氯化鈣濃度對附子效/毒的交互作用影響3D圖

圖8 浸泡時間與料液比對附子效/毒的交互作用影響3D圖

圖9 浸泡時間與氯化鈣濃度對附子效/毒的交互作用影響3D圖

圖10 氯化鈣濃度與料液比對附子效/毒的交互作用影響3D圖

2.3.5 驗證試驗 通過對圖形數據的分析,對回歸方程取一階偏導數等于零,優化得到最佳的提取工藝為浸泡19.2天、料液比1∶4.15、氯化鈣濃度25.37%。考慮實際條件,將浸泡時間、料液比及氯化鈣濃度分別調整為19天、1∶4、25%。取生附子分為3份,用以上條件進行浸泡,得到平均效/毒為(0.069±0.012),在理論值0.071的誤差范圍內,說明回歸模型建立得準確可靠。

3 討論

通過二極管陣列檢測器對樣品在190 nm～400 nm進行掃描,結果在235 nm波長處,各色譜峰分離度較好,故選擇235 nm作為檢測波長。本實驗通過查閱文獻,分別考察了流動相系統:乙腈-0.04 mol/L乙酸銨、乙腈-0.1%甲酸水及乙腈-0.04 mol/L乙酸銨(調0.04 mol/L乙酸銨溶液的PH=10),結果以采用0.04 mol/L 乙酸銨(PH=10)為流動相A,乙腈為流動相B時各色譜峰能實現良好分離且基線平穩;考察了柱溫對混合對照品分離效果的影響,結果得知在25℃、30℃、35℃的柱溫下均比較穩定,對色譜峰的分離效果影響不明顯,但考慮高柱溫過高會對儀器和柱子可能造成損耗,最后將柱溫設為25℃;最后考察了制樣方法,首先考察了在制樣過程中超聲提取時加入氨試液對色譜峰的影響,其次考察了0.05%鹽酸甲醇和異丙醇-二氯甲烷(1∶1復溶樣品),最終確定的制樣是需要加入氨試液,創造堿性環境,減壓濃縮的殘渣用0.05%鹽酸甲醇復溶。

本實驗將附子分別在膽巴溶液和氯化鈣溶液中浸泡20天時,與生附子相比,單酯和雙酯型生物堿在膽巴中的降低率分別達到62%和51%;在氯化鈣溶液中的降低率分別為60%和48%,之后兩種溶液中含量趨于平緩,說明一定程度上氯化鈣溶液浸泡附子可代替食用膽巴溶液浸泡,也證明了附子“用膽腌足二十日”的記載[14]具有一定的合理性與科學性。有研究表明附子在膽巴溶液(以氯化鈣計)中浸泡,在第9天到第25天時氯化鈣含量逐漸增加,達到26%是到飽和狀態,有防腐作用[15],與本實驗優化的用25%的氯化鈣溶液進行浸泡結果相符。

本研究運用星點設計效應面法對改進后的陜產附子泡膽工藝進行了優選,為后期陜產附子的進一步炮制研究及質量控制研究等奠定了基礎。