基于網絡藥理學研究補陽還五湯治療急性高原低氧性腦損傷的作用機制

黎潔 李永平 朱港星

在急進高原時,面臨急性低氧的情況下,人體的各個系統會受到嚴重影響,結構和功能也會隨之發生改變。大腦作為機體最主要的耗氧器官,在急性低氧時極容易出現腦功能和腦代謝的紊亂,甚至發生不可逆的腦損傷[1]。研究證實,大腦急性低氧時會導致海馬神經元急性死亡、神經毒性物質積累和神經炎癥[2]。

從中醫辨證角度出發,研究發現氣虛證是高原病的基本證候類型,其主要癥狀包括少氣懶言、呼吸氣短、神疲乏力,或有頭暈目眩,活動后諸證加重等[3],加之氣候寒冷,易傷人陽氣,脈中之血凝而留止,故高原病的基本病機多為氣虛血瘀[4-5]。

補陽還五湯是王清任在《黃帝內經》的指引下創立的針對氣虛血瘀證的名方[6],方中重用黃芪大補元氣,配當歸、赤芍、川芎、紅花、桃仁以活血化瘀,再加地龍疏通經絡,諸藥合用使氣足以推動血行[7]。研究發現補陽還五湯可以有效促進大腦神經元的修復[8],且數據表明補陽還五湯用于心腦血管疾病的防治是有效的,在臨床上得到廣泛運用[9]。本文旨在運用網絡藥理學了解補陽還五湯的潛在效應成分,對其防治高原急性低氧性腦損傷的作用機制進行初探。

1 材料與方法

1.1數據庫與統計軟件

TCMSP數據庫(https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)、Pubchem數據庫(https: //pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)、Swiss ADME數據庫[10](https: //www.swissadme.ch/)、Swiss Target Prediction數據庫[11](https: //www.swisstargetprediction.ch/)、UniProt數據庫[12](https: //www.uniprot.org/)、OMIM數據庫[13](https://www.omim.org/)、Gene Cards數據庫[14](https:www.genecards.org/)、Venny 2.1(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)、String數據庫(https://string-db.org/)、Cytoscape 3.7.1軟件、Metascape數據庫(https://metascape.org/gp/index.html)、微生信平臺(https://bioinformatics.com.cn/)。

1.2補陽還五湯的成分搜集與篩選

補陽還五湯由黃芪、當歸、赤芍、川芎、紅花、桃仁、地龍7味中藥組成,通過TCMSP數據庫收集以上中藥的化學成分,以口服生物利用度(oralbioavailability,OB)≥30%、類藥性(drug-likeness,DL)≥0.18為條件獲得符合條件的化合物。由于TCMSP無法檢索到地龍的化學成分,故通過查詢文獻收集地龍的有效成分,獲得有效成分的CAS號,在Pubchem中輸入CAS號得到地龍有效成分的分子結構圖,并下載分子結構圖的SDF格式文件,最后通過Swiss ADME進行篩選,篩選條件為胃腸道吸收(GI absorption)顯示“High”以及“Druglikeness”中的“Lipinski”“Ghose”“Veber”“Egan”“Muegge”至少滿足2個“Yes”,滿足以上條件即為地龍的有效成分。

1.3補陽還五湯有效成分作用靶點的獲取

在TCMSP數據庫“Related Targets”的“Targets Information”中輸入黃芪、當歸、赤芍、川芎、紅花、桃仁有效成分的Mol ID即可獲取作用靶點。保留經Swiss ADME篩選后符合條件的地龍有效成分,通過Swiss Target Prediction進行靶點預測,物種選為“Homo sapiens”,上傳地龍有效成分的SDF格式結構圖后開始預測,將靶點信息導出,剔除probability<0的靶點基因后即為地龍有效成分作用靶點。將以上獲取的靶點信息通過Uniprot數據庫進行標準化處理及去重后所得即為補陽還五湯有效成分作用靶點。

1.4疾病靶點篩選

高原急性低氧性腦損傷屬于高山病中的一類,故尋找疾病靶點時,使用高原低氧性腦損傷(hypobaric hypoxia brain injury, HHBI)和急性高山病(acute mountain sickness,AMS)為關鍵詞進行查尋。在OMIM在線數據庫中依次檢索“hypobaric hypoxia brain injury”“acute mountain sickness”,點擊“Download As”下載“Excel File”,共得到475個疾病基因;同法在Gene Cards在線數據庫中檢索關鍵詞后導出,共獲得315個疾病基因。

1.5藥物—疾病交集靶點的構建

將補陽還五湯各成分靶點及急性高原低氧性腦損傷疾病靶點輸入Venny 2.1中取得交集靶點,并繪制韋恩圖。

1.6繪制蛋白質相互作用網絡

將1.5篩出的藥物與疾病交集靶點導入String在線數據庫中的“Multiple proteins”,物種選擇為“Homo Sapiens”后進行搜索,將“minimum required interaction score”設置為“medium confidence(0.400)”,構建蛋白質相互作用(protein-protein interaction,PPI)網絡。

1.7“藥物-活性成分-靶點-疾病”網絡圖的構建

使用Cytoscape3.7.1繪制“藥物-活性成分-靶點-疾病”網絡圖,并利用內置工具Network Analyzer分析該圖的拓撲參數。

1.8GO功能及KEGG信號通路富集分析

將藥物與疾病的交集基因導入Metascape在線數據庫,物種設置為“H.Sapiens”,點擊“Custom Analysis”。參數設置為Min Overlap>3,P Value Cutoff<0.01,Min Enrichment>1.5。分別進行GO功能富集分析,包括生物過程(biological process,BP)、細胞組分(cellular component,CC)、分子功能(molecular function,MF)及KEGG信號通路富集分析。選取BP、CC、MF中最顯著的10個條目上傳至微生信平臺,進行數據可視化處理。KEGG中選取最顯著的20條信號通路的靶點,應用Sytoscape 3.7.1繪制“靶點-通路”網絡圖,同時用微生信平臺對數據進行可視化處理。

2 結果

2.1補陽還五湯的成分收集與篩選

通過TCMSP數據庫檢索補陽還五湯的有效成分,以OB≥30%、DL≥0.18為條件共收集到黃芪20個成分,當歸2個成分,赤芍29個成分,川芎7個成分,紅花22個成分,桃仁23個成分,共103個成分,刪除無作用靶點及重復成分后最終得到62個有效成分。TCMSP無法檢索地龍的有效成分,查閱文獻篩出地龍64個化學成分[15-16],并查詢64個化學成分的CAS號,運用CAS號在Pub chem數據庫中獲得每個化學成分的分子結構圖,經Swiss ADME篩選出滿足條件的45個化學成分,最后運用Swiss Target Prediction對地龍化學成分進行靶點預測,有作用靶點的有效成分共31個。共篩得補陽還五湯93個有效成分,其中黃芪20個,當歸2個,赤芍29個,川芎7個,紅花22個,桃仁23個,地龍31個,共有成分7個。

2.2補陽還五湯有效成分作用靶點的獲取

在TCMSP“Related Targets”中搜集各味中藥的有效成分作用靶點,分別得到赤芍120個,川芎31個,當歸51個,紅花339個,黃芪333個,桃仁91個;地龍有效成分經Swiss Target Prediction預測后獲得511個作用靶點。補陽還五湯共獲取1476個作用靶點,通過Uniprot數據庫標準化處理及去重后共獲得344個靶點基因。

2.3急性高原低氧性腦損傷疾病相關靶點的篩選

在OMIM數據庫、Gene Cards數據庫檢索“hypobaric hypoxia-induced brain injury”“high-altitude sickness”的靶點,經過去重后共獲得718個靶點基因。

2.4“藥物-疾病”交集靶點的構建

將補陽還五湯靶點基因與急性高原低氧性腦損傷疾病靶點基因導入Venny2.1獲取交集,共獲得63個交集靶點基因。見圖1。

圖1 補陽還五湯治療急性高原低氧性腦損傷的“藥物-疾病”靶點基因交集圖

2.5PPI網絡構建

將63個藥物與疾病的交集基因導入String在線數據庫,得到一個有63個節點、648條邊、“average node degree”為20.6的PPI蛋白互作圖。根據degree值大小排名靠前的有蛋白激酶B1(protein kinase B1,Akt1)、白介素(interleukin,IL)-6、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)、腫瘤蛋白P53(tumor protein p53,TP53)、血管內皮生長因子A(vascular endothelial growth factor,VEGFA)、IL-1β、缺氧誘導因子1(hypoxia inducible factor-1,HIF-1)α等靶點。見圖2。

圖2 補陽還五湯治療急性高原低氧性腦損傷的PPI網絡

2.6補陽還五湯“藥物-活性成分-靶點-疾病”網絡圖的構建

運用Cytoscape3.7.1繪制“藥物-活性成分-靶點-疾病”網絡圖,該網絡圖共165個節點,363條邊。165個節點中包括7個藥物節點,86個藥物活性成分節點,8個共同活性成分節點,1個疾病節點,63個基因節點,見圖3。根據節點degree值的大小選取前10個活性成分,見表1。

表1 “藥物—活性成分—靶點—疾病”網絡圖節點degree值排名前10的藥物有效成分

注:藍色圓形節點為補陽還五湯7種藥物名稱,紅色棱形節點為藥物共有活性成分,除紅色外的其它彩色棱形節點為藥物活性成分,黃色正方形節點為藥物、疾病共有靶點。

2.7GO功能及KEGG信號通路富集分析

將藥物與疾病的交集基因導入Metascape在線數據庫,分別進行GO富集分析及KEGG生物途徑分析。其中BP、CC、MF排名前10的條目如圖4所示。在BP中,對脂多糖的反應、對氧氣水平降低的反應、對激素的反應等排列靠前;在CC中,膜筏、分泌顆粒腔、受體復合物、細胞器外膜等排位靠前;MF主要包括血紅素結合、細胞因子受體結合、核受體活性、蛋白激酶結合等。

圖4 補陽還五湯治療急性高原低氧性腦損傷的BP、CC、MF通路富集圖

選取KEGG信號通路富集分析的前20個條目,篩出這20條通路的靶點基因,導入Cytoscape3.7.1繪制“通路-靶點”網絡圖,如圖5所示。KEGG信號通路富集分析如圖6所示,P值和關聯基因的數量決定節點的顏色和大小,顏色由紅變黃表示P值從小到大,節點由小變大表示關聯基因數量從少到多。結果顯示補陽還五湯治療高原急性低氧性腦損傷的機制主要涉及磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylin-ositol-3-kinase,PI3K)/Akt信號通路、HIF-1信號通路、Janus激酶(Janus kinase,JAK)/信號轉導子和轉錄激活子(signal transducers and activators of transcription,STAT)信號通路、Apelin信號通路等。

注:粉色節點為通路名稱,紫色節點為靶點基因。

3 討論

補陽還五湯出自王清任的《醫林改錯·下卷·癱痿論》,是治療氣虛血瘀證的代表名方,現被廣泛運用于心腦血管疾病的防治[17]。在急性低壓低氧時,大腦容易受到氧化應激和線粒體功能障礙的影響,導致神經元的損傷[18],海馬CA1區、CA3區神經元凋亡更為顯著,尤其是CA3區[19]。研究發現補陽還五湯通過調節炎癥、抑制血小板過度活化聚集從而改善凝血功能,具有活血化瘀及抗炎等作用,可用于治療多種因素導致的大鼠急性血瘀證[20];還可改善血液流變學,加快血流速度,增加腦血流量,改善腦的能量代謝,減少細胞凋亡,促進神經元的修復[21-22],促進海馬神經前體細胞增殖,從而誘導神經再生[23]。

從圖3、表1可知,補陽還五湯作用于急性高原低壓低氧性腦損傷時,木犀草素、楊梅酮、芒柄花黃素、山奈酚、鞣花酸、毛蕊異黃酮等有效成分具有較大節點,這可能是補陽還五湯中的核心有效成分,這些成分主要通過抑制炎癥反應、對抗氧化應激等途徑發揮神經保護作用。木犀草素抑制小膠質細胞產生促凋亡物質,積極促進生存信號的釋放,從而達到保護神經元的作用[24]。楊梅酮可改善LTP信號通路,恢復環磷腺苷效應元件結合蛋白,從而改善認知功能,此作用也可能與楊梅酮維持海馬部位氧化還原狀態相關[25]。芒柄花黃素通過激活PI3K/Akt信號通路減少海馬神經元的凋亡[26],還可以抑制核因子-κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)蛋白信號傳導,增強強核因子E2相關因子2(nuclear factor-E2-related factor 2,Nrf-2)/血紅素加氧酶信號通路傳導,改善認知功能[27]。山奈酚可增強Nrf-2的表達,從而抑制活性氧、TNF-α等炎性物質的產生與釋放[28],還可抑制Toll樣受體4、NF-κB、p38蛋白激酶等因子的激活從而達到保護神經元的作用[29]。鞣花酸通過調高B淋巴細胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)/Bcl-2相關X蛋白比值減少細胞凋亡[30]。毛蕊異黃酮可增強Nrf2抗氧化途徑,阻斷NF-κB通路從而減少炎癥的發生[31],還可通過參與自噬和凋亡為大腦提供神經保護[32]。到目前為止,高原急性低氧性腦損傷的主要機制主要包括神經細胞的代謝紊亂、大腦微血管滲透性增加及氧化應激[33],因此以上藥物化學成分對于急性高原低氧性腦損傷具有針對性作用。

根據補陽還五湯治療急性高原低氧性腦損傷PPI網絡圖中degree值的大小得出藥物與疾病相互作用的關鍵靶點有Akt1、IL-6、TNF、TP53、VEGFA、IL-1β、HIF-1α等,體現了補陽還五湯治療急性高原低氧性腦損傷多靶點的特點。Akt1是PI3K/Akt信號通路的中心節點,活化的Akt1磷酸化下游靶點,調節許多生物過程,包括細胞的存活與凋亡[34]。Akt1的激活需要PI3K介導,從而增加抗凋亡蛋白如Bcl-2的表達,以應對氧化應激保護細胞免受凋亡[35]。IL-6是促炎因子家族的成員,誘導各種負責急性炎癥的蛋白質表達,可激活B細胞分化為產生抗體的細胞[36],亦可調節免疫系統和神經系統[37]。研究證實IL-6經典信號傳導具有抗炎和保護作用[38]。TNF控制免疫系統的發展、細胞生存信號通路并參與調節代謝過程[39],故調控TNF對于促進組織穩態和對抗炎癥至關重要[40]。動物疾病模型揭示了兩種TNF受體(TNF receptor,TNFR)在中樞神經系統中的抗炎作用,研究發現TNFR1與炎癥變性有關,TNFR2與神經保護有關[41]。TP53既可以是自噬的激活劑,也可以是抑制劑;在缺氧的條件下,TP53通過抑制哺乳動物雷帕霉素靶蛋白信號傳導促進自噬激活,激活關鍵的自噬介質Beclin-1[42]。VEGFA在缺氧時上調,是內皮生長因子和血管通透性的調節劑,參與細胞增殖與存活、細胞遷移等反應[43]。HIF-1α是細胞對缺氧的主要反應劑[44],缺氧時細胞必須依靠糖酵解產生三磷酸腺苷,在缺氧條件下HIF-1α可以誘導糖酵解酶的表達從而持續產生三磷酸腺苷[45]。IL-1β由多種免疫細胞類型的炎癥信號誘導,在解決急性炎癥反應方面發揮有益作用[46]。

從KEGG信號通路富集分析來看,補陽還五湯作用于急性高原低氧性腦損傷主要涉及PI3K/Akt、HIF-1、JAK/STAT等信號通路。PI3K/Akt信號通路通過抑制B淋巴細胞瘤-2基因相關啟動子、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(cysteinyl aspartate specific proteinase,caspase)9和叉頭框蛋白O1來調節細胞凋亡,從而減輕神經損傷與認知障礙[47]。PI3K/Akt磷酸化可上調線粒體轉錄因子,防止線粒體膜電位的破壞[48],激活Bcl-2,抑制caspase釋放,減少神經元凋亡[49]。HIF-1可以緩解神經元損傷和死亡[50],其由對氧敏感的α亞基和結構性表達的β亞基組成[51]。其中HIF-1α是細胞對缺氧適應反應的關鍵轉錄介質,調節數百個參與全身組織和細胞適應低氧條件的基因[52],已被證實在缺氧環境和缺血性疾病中起著重要作用,其機制可能是上調IL-4、IL-10水平以及下調γ干擾素水平調節炎癥反應[53]。JAK/STAT信號通路涉及細胞增殖、分化、凋亡和免疫調節[54],該通路的異常激活或磷酸化與炎癥相關基因和許多神經退行性疾病轉錄增加有關,γ干擾素和IL-6是JAK/STAT通路的兩個最有效的激活劑[55],抑制JAK/STAT信號通路可以預防神經炎癥和神經退化[56]。

綜上所述,補陽還五湯中木犀草素、楊梅酮、芒柄花黃素、山奈酚、鞣花酸、毛蕊異黃酮等核心有效成分通過作用于Akt1、IL-6、TNF、TP53、VEGFA、IL-1β、HIF1α等核心靶點,通過參與細胞凋亡、炎癥、神經保護等相關反應和通路治療急性高原低氧性腦損傷,證明了補陽還五湯治療急性高原低氧性腦損傷具有多成分、多靶點、多通路的特點。由于補陽還五湯組方的復雜性、不同數據庫未實時更新等影響因素,本研究僅對補陽還五湯針對急性高原低氧性腦損傷機制進行了簡單的理論預測分析,其具體的機制以及治療效果還需通過實驗進一步驗證。