米香型白酒“增乳”工藝的優化研究

張龍，梁振榮，郝俊光，羅丹，萬瑞杰，葉靜萱，吳金燕，黎婷，李官連

(1.勁牌廣西天龍泉酒業有限公司，廣西河池 546400；2.欽州市食品風味分析與調控重點實驗室，北部灣大學食品工程學院，廣西欽州 535011)

白酒由多種風味物質組成，已報道的有1874種[1]。米香型白酒主體香較為簡單，由β-苯乙醇、乙酸乙酯以及乳酸乙酯構成[2-3]。以大米為原料，添加小曲進行糖化與發酵，蒸餾得到原酒[4]。其生產周期較短，入口柔和，米香純正，口感絕佳[5]。白酒的發酵是由多種微生物共同作用而成，釀造的主要功能微生物可分為三大類：酵母菌[6-7]（如釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae）、霉菌（如米根霉Rhizopus oryzae）和細菌（如巴氏醋桿菌Acetobacter pasteurianus)。

酯類物質具有呈香作用，與乙醇等物質發生反應使乙醇在人體內停留的時間減少[8]。米香型白酒中乳酸乙酯、乙酸乙酯等主要香氣物質的合成主要途徑有兩條[9-11]：一是由酯酶（Esterase）的催化產生；二是在醇酰基轉移酶（Alcohol Acyltransferase，AATFase）的作用下生成。酵母菌代謝產生的乙醇和乳酸菌代謝產生的乳酸構成乳酸乙酯的前體，再經酯化形成乳酸乙酯[12]。影響酯類形成的因素較多，包括pH 值、溫度、微生物菌落、溶解氧、設備尺寸等[13]。發酵過程中pH 值影響釀酒酵母的增殖，從而影響風味物質的形成[13]。發酵溫度可通過影響微生物一系列生理生化過程對酒質產生影響，如高溫提高雜醇油的產生[15-16]。地域導致的微生物差異也是影響白酒香型的一大因素[18]。Pires等[19]通過降低發酵液中的溶氧量、降低發酵罐靜壓、提高發酵溫度等途徑，有效增加了酯類的含量。將扣囊覆膜酵母（Saccharomycopsis fibuligera）與釀酒酵母以及米根霉混合后進行發酵，可增加短鏈酯類的含量[20-21]。

傳統米香型白酒釀造是基于天然微生物的經驗管理發酵模式，現代機械化釀造是基于純種制曲的大容器發酵。大容器釀造乳酸乙酯含量低是天龍泉酒業提升產品質量的瓶頸問題，為此天龍泉在釀酒酵母選育和釀造工藝優化方面進行了大量的嘗試。本文對新獲取的一株高產酯釀酒酵母Y4，進行提高乳酸乙酯含量的實驗室工藝條件優化，以確定Y4 酵母工業化應用的潛力。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

1.1.1 原材料

晚稻大米，淀粉含量75 %，南寧市欣和福糧油有限公司；根霉曲，糖化力34 g/100 g，廣西天龍泉酒業有限公司；酵母菌Y4，發酵力37 %vol，廣西天龍泉酒業有限公司。

1.1.2 試劑及耗材

內標：叔戊醇（純度99.5%）、乙酸正丁酯（純度99.5%），購自上海麥克林科技有限公司。

風味標準物質：棕櫚酸乙酯（純度99 %）、乙醛（純度40 %）、甲醇（純度99.9 %）、乳酸乙酯（純度98 %）、乙酸乙酯（純度99.9 %）、正丁醇（純度99.5 %）、壬酸乙酯（純度99 %）、苯乙醇（純度99.7 %）、異丁醇（純度99.9 %）、正丙醇（純度99.5%）、異戊醇（純度99%），購自上海麥克林科技有限公司。

1.1.3 儀器設備

低溫搖床，INNOVA 43R，上海巴玖實業有限公司；安捷倫氣相色譜儀，Agilent7890B，安捷倫科技有限公司；空氣發生器，QL-3，山東賽克賽斯能源有限公司；氫氣發生器，QL-300，山東賽克賽斯能源有限公司；電子調溫萬用爐，DK-98-II，天津市泰斯特儀器有限公司；鼓風烘箱，DHG-9240A，上海一恒科學儀器有限公司；純水過濾機，Intergal10，廣西南寧市博美生物科技有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 米香型白酒的工藝過程

稱取挑選過的大米100 g，將稱好的大米用清水清洗，兩次即可。洗好的大米，以大米與水1∶1，加入清水。蒸米時要適當攪拌米粒，不要粘鍋底，米飯要求內無生心，熟而不爛，手感柔軟，淀粉糊化。米飯蒸好后趁熱將米粒打散，米飯降溫到30 ℃方可加曲，加曲比例為0.25 %～4 %。加曲之后蓋上蓋子，放入30 ℃的恒溫箱進行糖化，時間持續24 h。米飯糖化到適宜程度后，按大米130 %的比例迅速加入純水。將加好純水的醪液放入恒溫培養箱，發酵時間為12 d，發酵溫度22～30 ℃。

1.2.2 米香型白酒發酵過程的單因素試驗

發酵溫度：在加曲比例1 %、釀酒酵母與根霉比例1∶10 的條件下，進行溫度22 ℃、24 ℃、26 ℃、28 ℃、30 ℃對乳酸乙酯含量影響的比對。

酒曲添加量：在發酵溫度28 ℃、釀酒酵母與根霉比例1∶10 的條件下，進行酒曲添加量為0.25 %、0.5%、1%、2%、4%對乳酸乙酯含量影響的比對。

酒曲比例：在加曲比例1 %、發酵溫度28 ℃的條件下，進行釀酒酵母與根霉比例0.25∶10、0.5∶10、1∶10、2∶10、4∶10 對乳酸乙酯含量影響的比對。

1.2.3 米香型白酒發酵過程的正交試驗

根據單因素試驗結果，對涉及的發酵溫度（A）、酒曲添加量（B）、釀酒酵母與根霉比例（C）進行三因素三水平正交試驗，見表1，檢測發酵12 d醪液的蒸餾液乳酸乙酯的含量，并對優化工藝做3次驗證試驗。

表1 因素水平表

1.2.4 酒精度的測定

將醪液進行蒸餾，靜止30 min 后用酒精計檢測。蒸餾時，取50 mL 蒸餾瓶，將醪液裝至刻度，加超純水（醪液與超純水比例為1∶1），安裝冷凝設備，水溫設置為5 ℃，餾出液用原容量瓶接收，在容量瓶外用冰水進行冷卻。

1.2.5 乳酸乙酯的測定

利用氣相色譜GC-FID 對測定酒精度后蒸餾液中的乳酸乙酯、乙酸乙酯、乙醛、甲醇、叔戊醇（醇類內標）、乙酸正丁酯（酯類內標）、正丙醇、異丁醇、正丁醇、異戊醇、壬酸乙酯、苯乙醇、棕櫚酸乙酯含量進行檢測。

1.2.6 總酸的測定

試劑配制參考GB/T 603—2002 以及GB/T 601—2016；操作步驟參考GB/T 10345—2007 白酒分析方法，酸堿滴定法，以酚酞指示劑指示終點，計算可得到總酸含量。

2 結果與分析

2.1 發酵溫度的優化

發酵溫度與乳酸乙酯含量緊密相關，溫度過低或是過高都不利于微生物生長[15]。由圖1 可知，發酵溫度為28 ℃時，乳酸乙酯含量最高，當發酵溫度達到30 ℃時，乳酸乙酯含量下降，說明太高的發酵溫度不適合微生物生長繁殖。基于此，選用27 ℃、28 ℃、29 ℃的發酵溫度進行后續正交試驗。

圖1 不同發酵溫度對乳酸乙酯含量的影響

2.2 加曲量的優化

發酵醪液中，乳酸菌將糖發酵得到的產物與乙醇反應得到乳酸乙酯，酒曲添加量影響發酵醪液中微生物體系的平衡。酒曲添加量過低時，發酵醪液容易被環境中的雜菌污染，影響酒質；酒曲添加量過高時，菌種自身的生長與繁殖會消耗過多的養分，不利于乳酸乙酯等風味物質的合成[24]。由圖2可知，酒曲添加量在0.25 %和0.5 %之間乳酸乙酯含量增加，0.5%時乳酸乙酯含量最高，加曲量達到1 %以上乳酸乙酯含量減少。基于此，采用0.4 %、0.5%、0.6%的酒曲添加量進行后續正交試驗。

圖2 不同酒曲添加量對乳酸乙酯含量的影響

2.3 曲比例的優化

發酵醪液中，酵母菌與乳酸菌等微生物存在相互促進作用，同時也有抑制作用[25]。糖化期間，米根霉將淀粉轉化為糖，供釀酒酵母等微生物作用。米根霉含量過低時，糖化程度過低，不能滿足釀酒酵母等微生物作用的需求；根霉含量過多時，糖化程度相對較大，糖分相對較高，過高的糖會使滲透壓過高，不利于釀酒酵母等微生物生長[26]。由圖3可知，釀酒酵母與米根霉比例為2∶10 到0.25∶10 時乳酸乙酯含量逐漸增高，0.25∶10 時含量最高，當比例為0.125∶10 時乳酸乙酯含量降低。基于此，采用0.1∶10、0.25∶10、0.4∶10 的釀酒酵母與米根霉比例進行正交試驗。

圖3 不同酒曲比例對乳酸乙酯含量的影響

2.4 米香型白酒發酵過程的正交試驗

2.4.1 米香型白酒發酵過程的正交試驗表分析

試驗結果見表2，通過對極差R 進行比較，可以發現影響因素中，B 占主要影響作用，A 次之，C 影響最小。由表3 可知，在顯著性水平為0.1 的條件下，B 因素對乳酸乙酯含量有顯著影響，A、C 因素影響無顯著性。即酒曲添加量在發酵過程中的影響作用最大，溫度的影響作用次之，釀酒酵母與根霉比例影響較小。試驗的優方案為B2A3C1，即酒曲添加量為0.5 %、發酵溫度為29 ℃、釀酒酵母與根霉比例0.1∶10 時為最優方案。

表2 正交試驗結果分析

表3 正交試驗結果方差分析

2.4.2 正交試驗對應酒精度及其他風味成分分析

不同正交試驗方案中最終醪液的蒸餾液風味指標含量見表4。由表4 可知，不同正交試驗方案中，酒精度為15.24 %～16.25 %，雜醇油控制在3.393 g/L 以下，乙醛含量為0.7～0.1 g/L，甲醇含量為0.006～0.01 g/L，乙醛0.019～0.105 g/L，乙酸乙酯0.052～0.523 g/L，正丙醇0.061～0.071 g/L，異丁醇0.445～0.559 g/L，異戊醇0.347～0.503 g/L，壬酸乙酯0.015～0.037 g/L，苯乙醇0.121～0.159 g/L。

表4 不同正交試驗方案中各指標含量

2.5 優方案的驗證試驗

對正交試驗的最優方案進行驗證，即發酵溫度29 ℃、酒曲添加量0.5 %、釀酒酵母與根霉比例0.1∶10。重復3 次試驗，對各指標結果取平均值，酒精度為15.8 %vol，乳酸乙酯含量0.335 g/L，乙酸乙酯含量0.086 g/L，正丙醇含量0.072 g/L，異丁醇含量0.478 g/L，正丁醇含量0.002 g/L，異戊醇含量0.412 g/L，壬酸乙酯含量0.031 g/L，苯乙醇含量0.125 g/L，棕櫚酸乙酯含量0.024 g/L，總酸含量0.15 g/L，衛生指標中雜醇油折算2.512 g/L，甲醇含量0.009 g/L，乙醛含量0.071 g/L。乳酸乙酯含量均大于正交試驗中任意組合的乳酸乙酯含量，即正交試驗所得出的優方案有可行性。

3 結論

通過單因素實驗與三因素三水平正交試驗對天龍泉優選Y4 釀酒酵母的產乳酸乙酯能力進行考察，確定其高產乳酸乙酯的實驗室優化工藝條件為：發酵溫度29 ℃、酒曲添加量0.5 %、釀酒酵母與根霉比例0.1∶10。最優條件下生產醪液的蒸餾液酒精度為15.8 %vol，乳酸乙酯含量0.335 g/L，乙酸乙酯含量0.086 g/L，可以確認Y4 釀酒酵母是1 株高產酯酵母，通過度數推算可以肯定該菌株具有生產國標規定的優質米香型白酒的潛力。本研究基于實驗室條件的優化，Y4 酵母在不銹鋼大罐條件下是否能夠應用需要進行放大試驗驗證。