武陵醬香型白酒七輪次高溫堆積細(xì)菌群落多樣性分析

孟鎮(zhèn)，張媛媛，田雨，郭新光，康忠媛，姬鈺，胡雯欽，陳家好*

（1.中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院有限公司，北京 100015；2.全國食品發(fā)酵標(biāo)準(zhǔn)化中心，北京 100015；3.中輕檢驗認(rèn)證有限公司，北京 100015；4.湖南武陵酒有限公司，湖南常德 415001）

中國白酒釀造具有悠久的歷史，以獨特的風(fēng)味和酒文化成為世界六大名酒之一[1]。白酒的發(fā)酵過程與其他烈酒有很大的不同，通常是由谷物，如高粱和大米等在固態(tài)條件下通過多種微生物發(fā)酵產(chǎn)生[2-3]。醬香型是中國白酒三大典型香型之一，主要產(chǎn)區(qū)包括貴州、四川、山東、湖南等，因其“無色（或微黃）透明，醬香突出，幽雅細(xì)膩，醇厚協(xié)調(diào)，回味悠長，空杯留香持久”的特點，深受國內(nèi)廣大消費者的喜愛，在國際市場上也屢獲好評[4]。醬香型白酒獨特的風(fēng)味主要源于其獨特的釀造工藝，傳統(tǒng)醬香型白酒采用“四高一長一大一多”的生產(chǎn)工藝，即高溫制曲、高溫堆積、高溫發(fā)酵、高溫餾酒和長期儲存[5]等工藝。高溫堆積工藝又稱“二次制曲”[6]，是醬香型白酒釀造過程中不可缺少的典型工藝之一，是指將糧食原料蒸煮糊化后，拌入高溫大曲，在窖池旁邊場地自然發(fā)酵的過程，期間可在空氣和環(huán)境中網(wǎng)羅、富集微生物，形成獨特的微生物群落結(jié)構(gòu)，共同參與醅料糖化發(fā)酵，積累微生物酶類，形成風(fēng)味前體物質(zhì)、產(chǎn)酯產(chǎn)香[7]。根據(jù)研究發(fā)現(xiàn)，高溫堆積的時間、溫度和微生物群落結(jié)構(gòu)等對醬香型白酒酒體風(fēng)味質(zhì)量等具有較大的影響[8]。

近年來，隨著高通量測序技術(shù)的不斷發(fā)展，由于其分析微生物群落多樣性具有快速、通量高、更具全面性的優(yōu)勢[9-12]，已被廣泛用于白酒釀造過程中微生物群落結(jié)構(gòu)的研究[13]。張春林等[14]采用高通量測序技術(shù)分析醬香型白酒二輪次堆積發(fā)酵過程中酒醅微生物群落結(jié)構(gòu)組成情況，并探討微生物與理化指標(biāo)的相關(guān)性；孫利林等[15]采用高通量測序技術(shù)解析醬香型白酒第四輪次釀造過程中高溫大曲、酒醅（堆積酒醅、窖內(nèi)酒醅）和窖泥的細(xì)菌多樣性，結(jié)果表明，堆積發(fā)酵微生物組成與發(fā)酵車間環(huán)境有關(guān)；王歡[16]采用高通量測序技術(shù)對醬香型白酒三輪、四輪、五輪次堆積發(fā)酵酒醅進(jìn)行研究，共檢出17 個細(xì)菌門、5 個真菌門，其中14 個細(xì)菌屬是堆積酒醅中的重要菌屬；王歡等[17]采用高通量測序技術(shù)對醬香型白酒機(jī)械化釀造不同輪次堆積發(fā)酵細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)多樣性進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，7 各輪次中共檢出14 個門，456 個屬，Caulobacter和Rhodococcus為機(jī)械化釀造過程中的特有菌屬，可能來源于機(jī)械設(shè)備和環(huán)境。

細(xì)菌是醬香型白酒堆積過程中生香和產(chǎn)酶的關(guān)鍵功能微生物，對酒體風(fēng)味的形成有著重要的影響，不同地區(qū)、季節(jié)高溫堆積發(fā)酵過程中微生物的結(jié)構(gòu)存在著明顯差異。本研究采用Illumina MiSeq高通量測序技術(shù)系統(tǒng)全面研究武陵醬香型白酒1—7 輪次高溫堆積酒醅樣品中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的分布特征和多樣性，有助于科學(xué)認(rèn)識醬香白酒不同產(chǎn)區(qū)的獨特性以及不同釀造環(huán)境對白酒釀造的影響機(jī)制，為醬香型白酒高溫堆積發(fā)酵調(diào)控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

樣品：取自湖北武陵酒有限公司（28.14°N，106.18°E）堆積發(fā)酵酒醅，采樣時間為2020 年9 月—2021 年7 月。堆積酒醅樣品從堆積1 d 開始至堆積結(jié)束（堆放的頂溫達(dá)到50 ℃）每天取樣。具體采樣方案如圖1 所示，每天分別從A（頂部）、B（中心）、C（中心層表面）、D（底層）、E（底層表面）同一位置進(jìn)行取樣，取樣后將每一輪同一天A—E點采集的5 個樣品等質(zhì)量混合后置于無菌自封袋中，-80 ℃保存?zhèn)溆谩⑼惠喆嗡杉臉悠返荣|(zhì)量混合均勻后作為該輪次高溫堆積樣品，最終，1—7 輪次共獲得7 個混合的樣品。

圖1 高溫堆積酒醅樣品采樣點

圖3 基于UniFrac 非加權(quán)的堆積酒醅樣品UPGMA 聚類

試劑及耗材：DNA 提取試劑盒，美國Omega BioTek 公司；AxyPrep DNA 凝膠回收試劑盒，美國AXYGEA 公司；rTaq DAN 聚合酶試劑盒，北京全式金生物技術(shù)有限公司；DNA marker，北京全式金生物技術(shù)有限公司；引物合成，生工生物工程（上海）股份有限公司。

儀器設(shè)備：ABI Gene AmpR 9700 型聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增儀，美國ABI 公司；DYY-8C 型高壓電泳儀，北京六一儀器廠；JS-680C 凝膠成像儀，上海培清科技有限公司；Illumina MiSeq 測序平臺，上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司；QuantiFlourTM-ST 藍(lán)色熒光定量系統(tǒng)，美國Promega 公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品DNA 提取及16S rDNA 測序分析

采用E.Z.N.A.? Soil DNA Kit（D5625-01）進(jìn)行樣品提取。完成基因組DNA 抽提后，使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測基因組DNA，用NanoDrop2000 進(jìn)行濃度的檢測。使用細(xì)菌的16S rDNA 通用引物對樣品提取的DNA 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，16S rDNA V4，可變區(qū)引物338F（5'-ACTCCTACGGGAGGCAG‐CAG-3'）和806R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTA‐AT-3），每個樣本3 個重復(fù)，將同一樣本的PCR 產(chǎn)物混合后用2 %瓊脂糖凝膠電泳檢測，使用AxyPrep DNA 凝膠回收試劑盒切膠回收PCR 產(chǎn)物，Tris-HCl 洗脫；2 %瓊脂糖電泳檢測。參照電泳初步定量結(jié)果，將PCR 產(chǎn)物用QuantiFlourTM-ST 藍(lán)色熒光定量系統(tǒng)進(jìn)行檢測定量，之后按照每個樣本的測序量要求，進(jìn)行相應(yīng)比例的混合。再利用Illumina MiSeq 進(jìn)行測序分析。

1.2.2 高通量測序

采用Illumina 高通量測序技術(shù)，基于Illumina MiSeq 測序平臺，分別對細(xì)菌V3—V4 高變區(qū)序列進(jìn)行測序分析（上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司）。

1.2.3 數(shù)據(jù)及圖像處理

采用Microsoft Office Excel 2016 進(jìn)行數(shù)據(jù)計算和分析。基于Illumina MiSeq 測序平臺，利用R 語言、Origin 作圖軟件、QIIME 軟件、SIMCA 14.1 繪制稀釋曲線、樣本層級聚類樹和豐度圖等。

2 結(jié)果與分析

2.1 測序統(tǒng)計結(jié)果和多樣性指數(shù)分析

利用Illumina Miseq 高通量測序平臺對不同輪次高溫堆積酒醅樣本進(jìn)行測序分析，由表1 可知，8個樣品中共得到細(xì)菌有效序列641505 條，平均每個樣本91644 條，樣品測序的覆蓋率均大于0.988，保證了測序數(shù)據(jù)質(zhì)量科學(xué)可靠。由圖2 稀釋性曲線可知，隨著采樣序列數(shù)的增加，樣品覆蓋度增加，當(dāng)測序序列數(shù)＞45000 時，樣品OTU 稀釋曲線趨于平坦，說明各樣本的測序數(shù)據(jù)量合理，測序深度足夠，與實際生物信息相符合，可覆蓋樣本中絕大多數(shù)細(xì)菌多樣性信息。進(jìn)一步說明本次測序結(jié)果質(zhì)量較高，科學(xué)可靠，本實驗測序結(jié)果可有效滿足后續(xù)對醬香型白酒高溫堆積酒醅樣品中微生物群落結(jié)構(gòu)的研究。

表1 高溫堆積酒醅樣品高通量測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計結(jié)果

Alpha 多樣性可以反映微生物群落的豐富度和多樣性[18]。選取Chao1 指數(shù)和Shannon 指數(shù)對7 個輪次高溫堆積酒醅樣品的Alpha 多樣性進(jìn)行分析，Shannon 指數(shù)用來估算樣品中微生物的多樣性，Shannon 值越大，說明群落多樣性越高；Chao1 指數(shù)是用Chao1 指數(shù)算法估計群落中含OTU 數(shù)目，在生態(tài)學(xué)中常用來估計物種總數(shù)，Chao1 值越大代表物種總數(shù)越多，表明群落的豐富度越高。由表1 可知，除4 輪次外，隨著輪次的增加，Shannon 指數(shù)整體呈現(xiàn)先上升后降低的趨勢，說明隨著輪次的增加細(xì)菌多樣性先增加后下降。Chao1 指數(shù)表明隨著輪次增加，物種的總數(shù)先上升后下降，且6—7 輪次物種總數(shù)遠(yuǎn)低于前5 輪次的物種總數(shù)。

2.2 細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成差異

使用非加權(quán)組平均法(unweighted pair-group method with arithmetic mean，UPGMA)對樣品進(jìn)行聚類，綜合序列同源性、OTU 的豐度和組成，了解武陵醬香型白酒不同輪次高溫堆積酒醅樣品細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異。圖3 為1—7 輪次高溫堆積酒醅樣品的聚類結(jié)果，由圖3 可知，各輪次高溫堆積酒醅細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成具有明顯差異。7 個輪次高溫堆積酒醅樣品聚類分成兩支，1 輪次與6 輪次、7 輪次聚為一支；3 輪次、5 輪次、4 輪次和2 輪次聚為一支，說明1 輪次、6 輪次和7 輪次與3 輪次、5 輪次、4輪次和2 輪次中的細(xì)菌群落具有明顯差異。

2.3 細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)多樣性

2.3.1 門水平群落結(jié)構(gòu)組成

通過USEARCH 將標(biāo)簽分組成具有97 %相似性的可操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU），將每個OTU 與數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，選取置信度閾值，即相似度在97 %以上的序列進(jìn)行物種分類，得到每個OTU 的分類水平，即門、綱、目、科、屬分類水平。

基于門水平細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)見圖4。如圖4 所示，7 個輪次的高溫堆積酒醅樣品中共檢測出39 個門，一輪次30 個，二輪次12 個，3 輪次13 個，4 輪次12 個，5 輪次18 個，6 輪次17 個，7 輪次18 個。在各輪次堆積樣品中，變形菌門（Proteobacteria）和厚壁菌門（Firmicutes）為各個輪次共有的優(yōu)勢細(xì)菌門（相對豐度≥1 %）。變形菌門（Proteobacteria）和厚壁菌門（Firmicutes）在不同輪次高溫堆積酒醅樣品中相對豐度占89.51 %以上，變形菌門（Proteobacte‐ria）隨著輪次的增加相對豐度占比逐漸升高，在第3 輪次時其相對豐度已達(dá)到50.91%以上，并在后面幾個輪次中穩(wěn)定在85.36 %～72.37 %，成為主導(dǎo)的優(yōu)勢菌門。厚壁菌門（Firmicutes）隨著輪次增加相對豐度占比呈整體下降趨勢，1—3 輪次中相對豐度較高在38.60 %以上，4—6 輪次時相對豐度穩(wěn)定在10.07 %～16.01 %，7 輪次相對豐度又有明顯的增加，達(dá)到24.41%。研究資料表明，厚壁菌門和變形菌門是濃香型[19-21]、醬香型[17]、清香型[22]和芝麻香型[21]白酒釀造過程中的主要細(xì)菌門。黎瑤依[23]采用高通量測序分析方法對茅臺地區(qū)醬酒高溫堆積酒醅進(jìn)行分析，認(rèn)為放線菌門和厚壁菌門為主要的細(xì)菌門。由此可見，本研究結(jié)論與其他研究者的結(jié)論具有一致性。

圖4 不同輪次主要細(xì)菌菌群落結(jié)構(gòu)（門水平）

2.3.2 屬水平群落結(jié)構(gòu)組成

基于屬水平細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)見圖5，如圖5 所示，7 輪次高溫堆積酒醅樣品中共檢測出756 個屬，1—7 輪次依次檢出293 個、108 個、167 個、170 個、291個、180 個和249 個屬，說明7 個輪次高溫堆積酒醅樣品中的主要細(xì)菌群落具有一定的差異。1 輪次高溫堆積發(fā)酵酒醅中的優(yōu)勢菌屬（＞1 %）有4 個，分別為乳桿菌屬（Lactobacillus）、小球菌（Pediococcus）、克羅彭施泰特氏菌屬（Kroppenstedtia）和醋桿菌（Acetobacter），總相對豐度為89.20 %；2 輪次有3 個，為乳桿菌屬（Lactobacillus）、醋桿菌（Acetobacter）和unclassified f__Bacteria，總相對豐度為98.32 %；3 輪次有4 個屬，為醋桿菌（Acetobacter）、乳桿菌屬（Lactobacillus）、unclassified f__Bacteria和勞爾氏菌屬（Ralstonia），總相對豐度為97.04 %；4 輪次有8 個屬，包括醋桿菌（Acetobacter）、乳桿菌屬（Lactobacillus）、unclassified_Lachnospiraceae、un‐classified f__Bacteria、克羅彭施泰特氏菌屬（Kroppenstedtia）、Muribaculaceae、Alistipes和Lachnospiraceae_NK4A136，總相對豐度為95.64 %；5 輪次有8個屬，包括醋桿菌（Acetobacter）、unclassified f__Bacteria、乳桿菌屬（Lactobacillus）、羅氏菌屬(Roseburia)、琥珀酸弧菌屬（Succinivibrio）、擬桿菌屬（Bacteroides）、Chloroplast和克羅彭施泰特氏菌屬（Kroppenstedtia），總相對豐度為85.06 %；6 輪次有6 個屬，包括醋桿菌（Acetobacter）、Massilia、芽孢桿菌屬(Bacillus)、乳桿菌屬（Lactobacillus）、克羅彭施泰特氏菌屬（Kroppenstedtia）和雙歧桿菌屬（Bifidobacterium），總相對豐度為90.86 %；7 輪次有8 個屬，包括醋桿菌（Acetobacter）、羅彭施泰特氏菌屬（Kroppenstedtia）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、乳桿菌屬（Lactobacillus）、Ureibacillus、高溫放線菌屬(Thermoactinomyces)和小球菌屬（Pediococcus），總相對豐度為91.24%。對各輪次優(yōu)勢菌屬進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，各輪次中共有的優(yōu)勢菌屬為乳桿菌屬（Lactobacillus）和醋桿菌（Acetobacter）。

圖5 不同輪次細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)（屬水平）

由于各輪次發(fā)酵酒醅的不斷蒸煮、發(fā)酵、糊化以及外界環(huán)境的改變，武陵醬香型白酒不同輪次高溫堆積酒醅樣品細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)多樣性明顯，具有一定的差異，但也具有一定的共性特征。在1—7 輪次中除1 輪次和5 輪次外，隨著輪次的增加，高溫堆積酒醅樣品中細(xì)菌群落菌屬逐漸增加；從3 輪次開始乳桿菌屬（Lactobacillus）相對豐度占比逐漸減少，醋桿菌屬（Acetobacter）逐漸增加，成為主導(dǎo)優(yōu)勢菌屬。1 輪次樣品的多樣性較高，且大于其他輪次，可能是由于1 輪次高溫堆積酒醅中除添加高溫大曲外，釀造環(huán)境中細(xì)菌種屬較高，額外添加的釀造高粱從外界帶入大量的微生物，使酒醅樣品中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)更為豐富。5 輪次的微生物結(jié)構(gòu)多樣性大于其他輪次，可能因為5 輪次時處盛夏時節(jié)，環(huán)境中溫度和濕度較高，有利于微生物的生長。

2.4 核心微生物群落及功能

參考Wolfe[24]和Hu[25]對核心微生物的定義，將平均相對豐度大于1 %，且至少出現(xiàn)在一個樣品以上的屬被定義為核心微生物屬。研究發(fā)現(xiàn)武陵醬香型白酒各輪次高溫堆積酒醅樣品中細(xì)菌平均大于1 %，且出現(xiàn)在1 個樣品以上的核心細(xì)菌屬有5個，分別為乳桿菌屬（Lactobacillus）、醋桿菌屬（Acetobacter）、芽孢桿菌屬(Bacillus)、克羅彭施泰特氏菌屬（Kroppenstedtia）和unclassified f__Bacte‐ria，分別占各輪次總豐度的86.75 %、98.36 %、95.044.73 %、89.99 %、77.73 %、80.38 %和83.69 %，相對豐度均大于77.73 %，說明這5 個菌屬一直穩(wěn)定存在于各輪次高溫堆積酒醅樣品中，是主導(dǎo)性菌群結(jié)構(gòu)，因此將這5 個菌屬認(rèn)定為武陵醬香型白酒核心微生物群落。

為進(jìn)一步解析武陵醬香型白酒高溫堆積過程中各輪次的核心微生物情況，對上述核心微生物在各輪次分布進(jìn)行了分析。乳桿菌屬（Lactobacillus）在1—3 輪次為優(yōu)勢菌屬，該菌屬在1 輪次相對豐度最高為83.16 %，2 輪次開始逐漸下降，到3 輪次時相對豐度降至36.47 %，4—7 輪次相對豐度較為穩(wěn)定，保持在2.55 %～3.81 %之間。結(jié)果與王歡等[17]在醬香型白酒機(jī)械化釀造7 輪次高溫堆積酒醅中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)研究較為一致。相關(guān)研究表明，乳桿菌屬（Lactobacillus）在多種香型白酒發(fā)酵過程都被檢出過，是中國白酒發(fā)酵過程中的主要功能細(xì)菌屬，其在白酒釀造過程中主要參與調(diào)控，可維持微生物間結(jié)構(gòu)平衡，同時在發(fā)酵過程中代謝產(chǎn)生乳酸、乙酸等有機(jī)酸類物質(zhì)，為白酒中風(fēng)味物質(zhì)的合成提供前體物，影響酒體風(fēng)格的形成[26]。醋桿菌屬（Acetobacter）在3—7 輪次為優(yōu)勢菌屬，該菌屬在1輪次相對豐度為1.02 %，2 輪次時上升至27.29 %，隨后逐漸上升，4 輪次時達(dá)到最大值為84.79 %，5輪、6 輪、7 輪次后逐漸下降，但相對豐度變化不大，在66.36 %～73.72 %。該菌屬是白酒釀造過程中重要的微生物，能夠在白酒發(fā)酵過程中將乙醇轉(zhuǎn)化為乙酸，為白酒中風(fēng)味物質(zhì)的合成提供前體物質(zhì)[23]。王歡等[16]對醬香型白酒3 輪、4 輪、5 輪次堆積發(fā)酵酒醅樣品的研究發(fā)現(xiàn)醋桿菌屬（Acetobacter）為3 輪、4 輪、5 輪次堆積發(fā)酵過程中的優(yōu)勢菌屬。

芽孢桿菌屬（Bacillus）在1—7 輪次中相對豐度較低，研究發(fā)現(xiàn)，該菌屬是清香型、醬香型白酒發(fā)酵過程的共有優(yōu)勢細(xì)菌屬[27]，能夠代謝產(chǎn)生乙偶姻及4-甲基吡嗪等白酒中重要的風(fēng)味物質(zhì)，對白酒的風(fēng)味物質(zhì)有重要貢獻(xiàn)[28]。克羅彭施泰特氏菌屬（Kroppenstedtia）為1 輪、4 輪、5 輪、6 輪、7 輪次的優(yōu)勢菌屬，研究表明，其為醬香型白酒[29]和芝麻香型白酒[30]大曲中優(yōu)勢菌屬，但其在白酒釀造過程中的主要功能及作用目前尚不明確。

3 結(jié)論

本研究采用Illumina MiSeq 高通量測序技術(shù)對武陵醬香型白酒1—7 輪次高溫堆積酒醅樣品細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行分析，7 個輪次中共檢出39 個門和756 個屬。門水平上，各輪次共有的優(yōu)勢菌門（相對豐度≥1 %）為變形菌門（Proteobacteria）和厚壁菌門（Firmicutes）；屬水平上，武陵醬香型白酒7個輪次高溫堆積酒醅樣品中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)具有多樣性特點，同時有一致性和差異性；細(xì)菌平均相對豐度大于1 %，且出現(xiàn)在1 個樣品以上的核心細(xì)菌屬有5 個，分別為乳桿菌屬（Lactobacillus）、醋桿菌屬（Acetobacter）、芽孢桿菌屬(Bacillus)、克羅彭施泰特氏菌屬（Kroppenstedtia）和unclassified f__Bac‐teria；各輪次共有的優(yōu)勢菌屬（相對豐度≥1%）為乳桿菌屬（Lactobacillus）和醋桿菌（Acetobacter）。本研究結(jié)果揭示了武陵醬香型白酒1—7 輪次高溫堆積酒醅樣品中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與特征，為醬香型白酒高溫堆積釀造過程中群落結(jié)構(gòu)變化規(guī)律解析及精準(zhǔn)調(diào)控提供了理論依據(jù)。