產(chǎn)四甲基吡嗪菌種的篩選及在釀酒中的應(yīng)用研究

彭奎，張磊，陳波，劉新宇，杜鵬程，劉念，劉義，王超凱，李覓，常少健，張蓓蓓，楊天涯，甘元甲，馮霞*

（1.四川省食品發(fā)酵工業(yè)研究設(shè)計院有限公司，四川成都 611130；2.四川省古藺郎酒廠有限公司，四川古藺 646523；3.新疆伊力特實業(yè)股份有限公司，新疆伊犁 835800；4.四川遠鴻小角樓酒業(yè)有限公司，四川巴中 636400；5.崇州市天宮酒廠，四川崇州 611230；6.四川佳樂酒業(yè)股份有限公司，四川瀘州 646000）

中國白酒中的四甲基吡嗪由美拉德反應(yīng)生成，在制曲和堆積發(fā)酵中產(chǎn)生，經(jīng)蒸餾帶入酒中，具有擴張血管、改善微循環(huán)及抑制血小板積聚的作用，賦予中國白酒以健康功能。高溫制曲、高溫堆積是醬香型白酒獨特的生產(chǎn)工藝，制曲階段和堆積過程產(chǎn)生的四甲基吡嗪是白酒中四甲基吡嗪的主要來源之一。四甲基吡嗪能產(chǎn)生類似醬香、醬油和麥醬香的風(fēng)味，其他的吡嗪類物質(zhì)都沒有，只能認(rèn)為吡嗪類物質(zhì)與醬酒有關(guān)，卻還沒有足夠有力的證據(jù)證明吡嗪及加熱香氣是醬香型酒的主體香氣物質(zhì)[1-4]。

醬香型白酒的生產(chǎn)周期為一年，在端午節(jié)期間開始制曲，重陽節(jié)期間下沙（投糧），經(jīng)歷九次蒸煮，八次發(fā)酵，七次取酒，再經(jīng)過分型定級，才能封壇入存，整個過程需要經(jīng)歷一年的時間。針對醬香型白酒在生產(chǎn)上的投資大、工藝復(fù)雜、生產(chǎn)周期長等特點，開發(fā)出一種微生物強化菌劑，用于醬香型調(diào)味酒的生產(chǎn)，對于縮短生產(chǎn)周期和創(chuàng)新生產(chǎn)工藝，研發(fā)出獨有的醬香風(fēng)格白酒有著重大意義。

1 材料與方法

1.1 材料

樣品：醬香型白酒堆積糟醅樣品5 個，高溫大曲樣品3 個。

編號：LJ-4-0：第四次堆積表面糟醅，2019 年樣品；LJ-4-30：第四次堆積距表面30 cm 糟醅，2019 年樣品；LJ2-4-0：第四次堆積表面糟醅，2020年樣品；LJ2-4-30：第四次堆積距表面30 cm 糟醅，2020 年樣品；LJ2-4DX：第四次堆積堆心糟醅，2020年樣品；DQB：白色大曲；DQH：黑色大曲；DQHuang：黃色大曲。

1.2 實驗方法

1.2.1 微生物分離

將采自醬香型白酒第四次堆積酒糟的兩個樣品LJ-4-0、LJ-4-30 加水混勻，經(jīng)80 ℃加熱20 min后稀釋涂瓊脂培養(yǎng)基平板，37 ℃培養(yǎng)48 h。挑取單菌落平板劃線，24 h 后再挑取單菌落于斜面培養(yǎng)24 h 后保存。LJ-4-0 樣品挑菌9 個，LJ-4-30 樣品挑菌10 個，共分離出19 株菌種，經(jīng)過分子鑒定確定為芽孢桿菌。所得菌種通過菌落及細胞圖像采集、分子鑒定后制成凍干管保藏于四川省微生物資源共享平臺菌種保藏中心。

1.2.2 產(chǎn)醬香風(fēng)味物質(zhì)的菌種篩選

麩皮培養(yǎng)基：麩皮過40 目篩，稱取10 g 裝入500 mL 三角瓶中，加水190 mL，紗布封口，121 ℃滅菌20 min。接入培養(yǎng)8 h 的菌液5 mL，36 ℃±1 ℃，160 r/min 培養(yǎng)9 d，測定四甲基吡嗪、4-甲基愈創(chuàng)木酚、4-乙基愈創(chuàng)木酚、糠醛4種風(fēng)味物質(zhì)含量。

樣品預(yù)處理：發(fā)酵液5000 r/min 離心，取上清液5 mL，加NaCl 1.4 g 至飽和，渦旋振蕩，加入2 mL二氯甲烷溶劑，渦旋萃取1 min，6000 r/min 離心5 min，取下清液，0.45 μ m 膜過濾，進行GC-MS 分析。取4 輪次堆積酒糟（430105）、6 輪次堆積酒糟(6105、694）及大曲（DQB、DQH、DQHuang)作對照，滅菌的麩皮培養(yǎng)基（0）做空白。

復(fù)篩利用高粱糖化液為培養(yǎng)基，接入培養(yǎng)8 h的菌液5 mL，36 ℃±1 ℃，160 r/min 培養(yǎng)9 d。測定風(fēng)味物質(zhì)四甲基吡嗪、糠醛兩種風(fēng)味物質(zhì)含量。

驗證試驗方法：利用合成培養(yǎng)基與高粱糖化液發(fā)酵；設(shè)置靜置（低氧）與振蕩（高氧）培養(yǎng)方式；前期高溫（40 ℃，3 d），后期低溫（36 ℃，6 d）發(fā)酵。

1.2.3 宏基因組測序分析

利用宏基因組測序分析。

1.2.4 模擬堆積發(fā)酵試驗

利用第7 次堆積后的酒糟+高粱進行模擬堆積試驗。菌種LJ-02 添加到蒸餾取酒后的酒醅中，加入10 %高粱，菌種添加量為2 ‰，置于培養(yǎng)箱模擬堆積發(fā)酵。前3 d 溫度由10 ℃逐漸升至45 ℃，降至35 ℃保持27 d。添加方式分別為：菌液，濾液（0.45 μ m 過濾菌液），菌體（離心，洗滌3次）。

1.2.5 中試車間生產(chǎn)試驗

菌種LJ-02接01號液體培養(yǎng)基，37 ℃，180 r/min培養(yǎng)36 h。第二輪蒸酒后，酒糟攤晾，加入酒曲，實驗組加5 ‰菌液，混勻后堆積，溫度升至45 ℃后入窖1 個月；入窖1 個月酒糟加入適量糠殼后蒸酒，接酒隨時測定酒精度，分為頭酒和尾酒，當(dāng)酒精度低于30%vol 時，更換容器接酒。

1.2.6 企業(yè)釀酒生產(chǎn)試驗

實驗方法：選定1 個窖池作為實驗窖，按照現(xiàn)有生產(chǎn)工藝（1 窖投糧20 噸，22甑），選擇1 甑堆積糟醅的量作為實驗樣，在堆積后入窖前，對應(yīng)1 甑糟醅900 kg 的量加入9 kg 微生物強化菌劑，入窖置于上層糟醅，待發(fā)酵期結(jié)束后蒸餾取酒。對照樣為現(xiàn)有正常生產(chǎn)窖池生產(chǎn)工藝。

2 結(jié)果與分析

2.1 微生物分離（表1、表2、圖1）

表1 堆積糟醅和高溫大曲樣品分離微生物菌株和計數(shù)表

圖1 LJ-4-0 和LJ2-4-30 樣品菌落

表2 LJ-4-0 和LJ-4-30 樣品分離微生物菌落形態(tài)

表3 原酒樣品類型和來源

大曲及堆積酒糟中細菌含量差異不明顯，但堆積酒糟的酵母含量比大曲中高，大曲中霉菌含量比堆積酒糟含量高。

2.2 產(chǎn)醬香風(fēng)味物質(zhì)的菌種篩選

從圖2 可以看出，菌株產(chǎn)四甲基吡嗪及糠醛能力較強，進行復(fù)篩試驗。

圖2 菌種發(fā)酵液的4種風(fēng)味物質(zhì)含量

從圖3 可以看出，利用高粱液發(fā)酵產(chǎn)四甲基吡嗪產(chǎn)量低，利用復(fù)合培養(yǎng)基產(chǎn)量高，比試驗組高出5 倍多。選取菌種LJ-02、菌種LJ-04、菌種LJ-32、菌種LJ-33 號菌發(fā)酵復(fù)合培養(yǎng)基進行驗證試驗。

圖3 菌種發(fā)酵液的兩種風(fēng)味物質(zhì)含量

從圖4 可以看出，靜置與振蕩條件下4 株菌株四甲基吡嗪產(chǎn)量不一樣，菌種LJ-02 利用合成培養(yǎng)基與高粱糖化液在振蕩條件下產(chǎn)量最高，達313.8 mg/L。菌株產(chǎn)四甲基吡嗪對含氧條件需求不同，利用高低溫發(fā)酵方式利于四甲基吡嗪產(chǎn)生。

圖4 不同條件下菌種發(fā)酵液的四甲基吡嗪含量

2.3 宏基因組測序分析

選取了大曲、第四次堆積表面糟醅及第四次堆積堆心糟醅3 個樣品分析其中微生物群落分布，見圖5—圖8。

圖5 細菌微生物相對豐度圖

圖6 細菌微生物群落分布圖

圖7 真菌微生物相對豐度圖

圖8 真菌微生物群落分布圖

3 個樣品細菌各分類單元在數(shù)量上差異不明顯，厚壁菌門（Fimicutes）、放線菌門(Actinobacteria)與變形菌門（Proteobacteria）是堆積糟醅與大曲的共同優(yōu)勢菌群，但3種優(yōu)勢菌群數(shù)量上的差異極其顯著。大曲中數(shù)量最多的菌群分別為厚壁菌門（Fimicutes）、放線菌門(Actinobacteria)與變形菌門（Proteobacteria），堆積酒糟中數(shù)量最多的菌群分別為變形菌門（Proteobacteria）、厚壁菌門（Fimicutes）與放線菌門(Actinobacteria) 。和堆積酒糟中優(yōu)勢菌群的差異不顯著。

3 個樣品各真菌分類單元在數(shù)量上差異極其顯著，大曲中各分類單元數(shù)量上最少，其次為堆積中心糟醅，數(shù)量最多的為堆積表面糟醅。3 個樣品真菌的共同優(yōu)勢種群為子囊菌門(Ascomycota)。

2.4 微生物功能菌劑的試驗研究

2.4.1 模擬堆積發(fā)酵試驗

由圖9 可知，四甲基吡嗪產(chǎn)量最高為加曲加菌液組，達到376.4 mg/L，最低為不加曲對照57.9 mg/L。加曲組比不加曲組四甲基吡嗪產(chǎn)量高，加菌種比不加菌種四甲基吡嗪產(chǎn)量高，加濾液比單加菌種四甲基吡嗪產(chǎn)量高，加菌液比單加菌種和濾液四甲基吡嗪產(chǎn)量高（不加曲情況相反），加曲和加菌液對四甲基吡嗪產(chǎn)量有相互促進作用。

圖9 菌種LJ-02 模擬堆積發(fā)酵的四甲基吡嗪含量

圖10 菌種LJ-02 中試試驗的四甲基吡嗪含量

圖11 實驗及取樣示意圖

2.4.2 中試車間生產(chǎn)試驗

經(jīng)中試試驗，加菌組比不加菌組四甲基吡嗪含量高，尾酒中四甲基吡嗪含量比頭酒中高，酒體中的四甲基吡嗪含量比酒糟中含量高。添加篩選的菌種LJ-02 比不添加四甲基吡嗪含量高，說明菌種LJ-02 在醬香酒發(fā)酵過程中有助于四甲基吡嗪含量的提升。

2.4.3 企業(yè)釀酒生產(chǎn)試驗

對原酒樣品進行色譜分析（酯、醇、酸、四甲基吡嗪、糠醛、4-乙基愈創(chuàng)木酚等），對比分析實驗樣與對照樣的差異。

從表4 可以看出，實驗窖A 上層糟醅（添加9 kg微生物強化菌劑）產(chǎn)酒的乳酸乙酯、四甲基吡嗪含量最高，相比于現(xiàn)有生產(chǎn)工藝，增幅明顯，但糠醛含量有所下降。

表4 釀酒生產(chǎn)實驗的部分指標(biāo)對比

3 結(jié)論

在醬香型白酒高溫大曲、堆積糟醅分離篩選出產(chǎn)四甲基吡嗪風(fēng)味物質(zhì)的功能性菌種1 株，菌種編號LJ-02，為芽孢桿菌，耐高溫、耐酸，菌種保藏編號SICC1.1847。將功能微生物制備成菌劑后進行模擬堆積、中試試驗、釀酒生產(chǎn)研究，發(fā)現(xiàn)其對四甲基吡嗪含量提高有明顯影響。