窖泥中放線菌的分離鑒定及生理特性研究

黃書琴，鄭若欣，江科，丁俊，朱海，任志強，3*

（1.四川輕化工大學釀酒生物技術及應用四川省重點實驗室，四川宜賓 644000；2.四川國檢檢測有限責任公司，四川瀘州 646000；3.中國輕工業釀酒生物技術及智能制造重點實驗室，四川宜賓 644000）

濃香型白酒的釀造以窖泥為基礎，窖泥中的微生物起關鍵作用，不同年齡和不同地理區域的微生物群落有著十分明顯的差異，某些微生物種群是白酒特有揮發性化合物的活躍群體[1-2]。放線菌作為釀酒工業生產中的四大微生物之一，在白酒釀造中扮演著極為重要的角色[3]。目前,在傳統白酒行業生產領域,有關放線菌的研究主要集中在白酒發酵過程中大曲、曲房、酒醅、以及窖池中放線菌的分離鑒定[4，19]，也有少量文獻[4-6，18]對與白酒釀造有關的放線菌代謝物質和發酵特性進行了研究報道。由于放線菌不是釀造中的優勢菌群，且作用機理尚不清楚，因此與細菌、酵母菌、霉菌在傳統白酒釀造中相比，對放線菌的研究報道相對較少。目前，少量研究顯示放線菌不僅積極參與土壤中有機物質的轉化，還會產生許多活性酶類如淀粉酶，纖維素酶等，以促進高分子化合物降解，被降解的物質在酵母菌和細菌的作用下產生乙醇、乙酸、乙酸乙酯等，同時還會水解蛋白質生成氨基酸，為己酸菌的生長提供前體物質[7]。因此，本研究從濃香型白酒窖泥中分離放線菌株，對目的菌株進行多相分類鑒定及部分生理代謝特性研究。該研究不僅能增加窖泥中有關放線菌研究領域的內容，還能探究放線菌在窖池中的性能以及在白酒釀造中如何發揮作用，為更好地研究混菌發酵提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑

1.1.1 樣品

取自川西某酒廠的濃香型窖泥，取窖底的窖泥，采用5 點取樣法，取出后分裝并抽真空密封，冰袋送回，4 ℃保存，及時處理。

1.1.2 試劑

可溶性淀粉、磷酸氫二鉀、七水硫酸亞鐵、重鉻酸鉀，成都市新都區木蘭鎮工業開發區；硝酸鉀、七水硫酸鎂、氯化鈉、瓊脂粉，成都市科龍化工試劑廠；胰蛋白胨、酵母提取物，北京雙旋微生物培養基制造廠；魯戈氏碘液，50 mg/L K2Cr2O7溶液，75 mg/L K2Cr22O7溶液，1 mg/mL 青霉素溶液，2 mg/mL 青霉素溶液，3 mg/mL 青霉素溶液，18 mg/mL 的制霉菌素溶液，50 倍TAE 緩沖溶液，質量分數1 %的瓊脂糖溶液。

1.1.3 培養基

高氏一號固體培養基[8]：可溶性淀粉20.0 g、KNO31.0 g、K2HPO40.5 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、Na‐Cl 0.5 g、FeSO4·7H4O 0.01 g、蒸餾水1000 mL、瓊脂粉20.0 g、pH 7.4～7.6，121 ℃、0.1 MPa 下滅菌20 min。LB 培養基[9]：酵母提取物5.0 g、胰蛋白胨10.0 g、NaCl 5.0 g、瓊脂粉20.0 g（固體添加）、蒸餾水1000 mL、pH 7.2～7.4，121 ℃、0.1 MPa 下滅菌20 min。水瓊脂培養基：瓊脂粉20.0 g，蒸餾水1000 mL，自然pH 值，121℃、0.1 MPa 下滅菌15 min。淀粉水解培養基[10]：淀粉2.0 g、牛肉膏2.0 g、蛋白胨17.5 g、瓊脂粉17.0 g、蒸餾水1000 mL、pH7.0，121 ℃、0.1 MPa下滅菌20 min。

1.1.4 儀器設備

超凈工作臺JJ-CJ-2FD，蘇州凈化設備廠；電熱恒溫干燥箱labserv-LS-0610，上海一恒科儀器有限公司；電鏡掃描儀DM3000，德國徠卡儀器有限公司；恒溫震蕩培養箱ZWYR-D2403，上海智城分析儀器有限公司；生化培養箱LS-1201，上海三發科學儀器有限公司；凝膠成像儀Chemi‐DocXPS+，美 國BIO-RAD公司；PCR 儀C1000 Touch，美國BIO-RAD 公司；電泳儀164-5070，美國BIO-RAD 公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 放線菌株的分離純化

本試驗采用稀釋涂布平板法并用以下幾種預處理方式[11]對窖泥樣品進行放線菌的分離。

（a）干熱處理：準確稱取10 g 窖泥樣品于錐形瓶中后封口，120 ℃干熱處理1 h，取出加入90 mL無菌水，28 ℃、180 r/min 振蕩搖勻3 h 備用。

（b）濕熱處理：水浴鍋內65 ℃處理30 min，其余操作同（a）。

（c）無特殊處理：其余操作同（a）。

抑制劑濃度：制霉素溶液記為（A）；50 mg/mL重鉻酸鉀記為（B1）；75 mg/mL 重鉻酸鉀記為（B2）；青霉素溶液記為（C1）1 mg/mL、（C2）2 mg/mL、（C3）3 mg/mL，抑制劑均在無菌條件下添加到培養基中。

1.2.2 放線菌株的鑒定及生理特性

1.2.2.1 單菌落形態學特征觀察

將分離得到的放線菌菌株點種在高氏一號固體培養基平板上，28 ℃倒置培養3～5 d，觀察菌落形態；進一步無菌操作制片，采用顯微鏡觀察放線菌的個體形態。

1.2.2.2 放線菌株的生理生化試驗

（1）生長曲線的測定。挑取放線菌單菌落接種于10 mL 高氏一號液態培養基，28 ℃、120 r/min 震蕩培養72 h，該培養液作為測定生長曲線的種子液。以1 %的接種量將種子液接種于裝有150 mL高氏一號液態培養基的500 mL 三角瓶中，置于28 ℃、120 r/min 震蕩培養，每隔6 h 取樣檢測菌體生長狀況，每株放線菌接種27 瓶，每個時間點取樣3 瓶。菌體生長狀況采用菌體干重法進行表示，具體操作為：將濾紙烘干稱重初始質量m1，將每瓶混合均勻后取100 mL 菌液過濾，烘干后稱重結束質量m2，100 mL 菌液中所包含的菌體質量為m2-m1。

（2）最適溫度測定。將放線菌種子液以體積分數2%的接種量接入已滅菌的50 mL 高氏一號液體培養基中，設置培養溫度20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃，每組溫度設置3 個平行，于120 r/min，恒溫培養3 d。以干重法表示菌體生長狀況。

（3）最適pH 測定。用10 mol/L NaOH 調節高氏一號液體培養基pH 值至5.0、5.5、6.0、6.5、7.0，每組pH 值設置3 個平行，按照（2）的方法接種后于35 ℃，120 r/min，培養3 d。以干重法表示菌體生長狀況。

（4）乙醇耐受力測定。用無菌的乙醇調節高氏一號液體培養基酒精度至2 %vol、4 %vol、6 %vol、8%vol、10%vol，每組酒精濃度設置3 個平行，按照（2）的方法接種后于35 ℃，120 r/min，培養3 d。以干重法表示菌體生長狀況。

1.2.2.3 分子生物學鑒定

本研究按照Takara 全基因組[12]提取試劑盒方法對分離純化后的細菌進行DNA 提取。以上游引物[13]27F：5'-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3'和下游引物[13]1492r：5'-ACGGTTACCTTGTTAC‐GACTT-3'進行PCR 擴增。擴增程序為94 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，共35 個循環，最后72 ℃補充延伸10 min，16 ℃保溫5 min。取2 μ L PCR 產物用1 %瓊脂糖凝膠檢測PCR 擴增效果；將PCR 得到的基因產物送至上海生工生物工程有限公司進行測序。測序結果在NCBI 進行Blast 比對分析；將所得序列在Contigexpress 軟件上拼接及校正，獲得Fasta 格式文件，按照Neighbor-joining 法在Mega7.0 軟件上構建系統發育樹。

1.2.3 產抗生素測定

本試驗采用雙層瓊脂擴散法測定抗生素。采用LB 固體培養基，將滅菌后的牛津杯垂直放入水瓊脂表面，在冷卻至50 ℃的LB 固體培養基中接種體積分數為7 %的指示菌液，混勻后倒入底層水瓊脂，待其凝固后取出牛津杯。在形成的空洞內加入200 μ L 菌液，靜置30 min 后在37 ℃的恒溫條件下培養12 h。本試驗分別做革蘭氏陰性菌檢測和革蘭氏陽性菌檢測，在形成的3 個孔洞內加入菌液，1個孔洞內加入相同量50 mg/L 重鉻酸鉀溶液作為標準對照。

1.2.4 產淀粉酶測定

用點種法將分離純化后的放線菌接種于高氏一號固體培養基，置于37 ℃的恒溫條件下培養，平板中明顯出現生長良好的菌落時滴加魯戈氏碘液觀察透明圈。

2 結果與分析

2.1 窖泥中放線菌的分離

從土壤中分離放線菌前，對土壤的預處理尤為關鍵。不同的處理方式和抑制劑的添加會篩選出不同功能的放線菌株，同時在一定程度上也會抑制其他非目的菌株的生長，還會激發稀有放線菌孢子的生長，提高出菌率[14]。本研究采用1.2.1 所示3種預處理方法處理窖泥樣品。分離結果如表1 所示，由表1 可知，65 ℃濕熱處理加制霉素18 mg/mL、青霉素3 mg/mL 的組合（bAC3）及不做特殊處理加K2Cr2O750 mg/mL、青霉素1 mg/mL 的抑制劑組合（cB1C1）均分離出放線菌，其余組合均未能分離出放線菌。對分離出的放線菌分別編號為X、Z。結果表明，窖泥中放線菌的分離較為困難，尤其是干熱處理條件下，放線菌菌體和孢子受到高溫和水分的影響失去活性，在培養基上幾乎無法生長。干熱處理作為一種對土壤普遍使用的預處理方式[11]，濕熱處理窖泥樣品從中篩選放線菌株可能是一種更為理想的方式。

表1 分離培養結果

2.2 窖泥中放線菌株的形態學鑒定

本試驗從窖泥中分離、純化出2 株具有放線菌菌落形態特征的菌株，分別命名為菌株X 和菌株Z。菌株X 形態學鑒定結果見圖1，菌株X 在高氏一號培養基中于28 ℃倒置培養3 d 后菌落呈不規則圓狀，白色或淡黃色，菌落質地干燥，表面起粉，有明顯土腥味（圖1-A）；在40 倍顯微狀態下菌落呈絨毛發射狀（圖1-B）；在1000 倍顯微鏡下菌株X由長菌絲和分支菌絲組成，存在孢子鏈且呈直鏈狀（圖1-C）。菌株Z 形態學鑒定結果見圖2，菌株Z在高氏一號培養基中于28 ℃倒置培養3 d 后菌落呈圓狀，白色，菌落質地干燥，有明顯土腥味（圖2-A）；在40 倍顯微狀態下菌落呈發射狀（圖2-B）；在1000 倍顯微鏡下菌株Z 由長菌絲和分支菌絲組成（圖2-C）。參考《伯杰氏細菌鑒定手冊》符合鏈霉菌屬的基本形態，因此，初步將該兩株放線菌歸為鏈霉菌屬。

圖1 菌株X 的菌落及菌絲形態

圖2 菌株Z 的菌落及菌絲形態

2.3 窖泥中放線菌的分子生物學鑒定

為進一步確定菌株X 和菌株Z 的分類學地位，將兩株菌的DNA 提取后進行PCR 擴增，結果顯示（圖3），2 株放線菌的PCR 產物條帶單一，符合測序條件。將擴增后的樣品進行送樣測序，測序結果在NCBI 的GenBank 數據庫中進行同源序列搜索，分別獲得7 個與菌X 和8 個與菌Z 同源性較高的模式菌株的16S rDNA 序列。通過MEGA7.0 軟件進行多序列比對，按照Neighbor-joining 法在Mega7.0 軟件上構建系統發育樹，從聚類分析樹狀圖可以看出（圖4），在屬分類水平上，2 株菌屬于鏈霉菌屬（Streptomyces），在種水平上，X 菌與Streptomyces griseoplanus菌株YJ-RT8 聚成一群，并穩定單獨成枝，序列同源性為99.72 %；Z 菌株與Streptomyces drozdowiczii菌株1136 聚類在一個系統發育分支上，序列同源性為99.72%。根據《伯杰氏細菌鑒定手冊》的鑒定方案，并結合菌落形態特征、顯微鏡形態特征分析，確定X 菌株屬于產灰鏈霉菌（Streptomyces griseus），Z 菌株屬于德氏鏈霉菌（Streptomyces drozdowiczii）。

圖3 16S rDNA PCR 擴增結果

圖4 菌株系統發育樹

2.4 窖泥中放線菌的生理特性

2.4.1 放線菌的生長曲線

本研究采用干重法繪制2 株菌的生長曲線，結果見圖5。由于菌株進入新環境后的生長發育需要一定的時間適應和調節，放線菌X 和放線菌Z 在0～12 h 時均處于生長延滯期，在12～48 h 時間段內菌株干重呈幾何級數增長，此時對數生長期出現，在培養48 h 后菌株生長量達到最大，此階段菌株的形態、生理活性等都比較典型，對外界環境因素敏感，探究遺傳性能多選用此時期的菌體。

圖5 兩株放線菌的生長曲線

2.4.2 放線菌的最適生長溫度

本實驗兩株放線菌最適生長溫度結果見圖6。菌株X 的干重隨著溫度的升高呈先增加再降低的趨勢，在25 ℃有最大干重，表明其最適生長溫度在25～30 ℃之間，在20～25 ℃之間干重差比較大，表明在這個溫度范圍內X 菌株的代謝十分活躍，菌株的生長發育對該段溫度的變化非常敏感。在25 ℃時Z 菌株也有最大干重，最適生長溫度也在25～30 ℃之間，可能的原因是在窖池中發酵過程中心最高溫度在35 ℃左右，放線菌群的生長發育在該溫度范圍下得到適應。

圖6 兩株放線菌的最適生長溫度

2.4.3 放線菌的最適生長pH 值

兩株放線菌的最適生長pH 值結果見圖7，菌株X 在pH6.5 時有最大干重，在pH5.0 時有最小干重，整體呈先上升再下降的趨勢，表明放線菌株X 有較差的耐酸性且對酸度變化十分敏感，適宜在弱酸環境下生長，可能是濃香型白酒發酵過程中窖泥長期浸泡于黃水中，黃水呈弱酸性，使窖泥中上層也呈弱酸性，窖泥中的微生物經過長期生長發育代謝馴化為適宜弱酸環境，因此能在此環境下良好生長。菌株Z 表現為對酸性環境的變化不敏感，但同樣在pH6.5 時有相對較大干重，表明在此酸性條件下菌株Z 生長最為活躍。

圖7 兩株放線菌的最適生長pH值

2.4.4 乙醇耐受力測定

兩株放線菌乙醇耐受力結果見圖8，隨著酒精濃度增大，兩株菌的長勢均減弱；菌株X 以及菌株Z 分別在酒精度為10%vol 以及酒精度為8%vol 時失去活性。在白酒發酵過程中窖池中的酒精積累是一個由少到多的過程，說明存在著對放線菌株生長促進作用由大到小的酒精濃度梯度，放線菌在窖池中得到了長期的馴化，使得窖泥中的放線菌可以慢慢適應酒精因素。

圖8 兩株放線菌的乙醇耐受力

2.4.4 放線菌株產抗生素特性

本試驗采用雙層瓊脂擴散法分別對得到的兩株放線菌進行革蘭氏陽性菌以及革蘭氏陰性菌抑菌性實驗，通過觀察抑菌圈的有無及大小反應兩株菌產抗生素的情況，結果見圖9。兩株菌在陰性菌平板上和陽性菌平板上均無明顯抑菌圈，說明兩株菌的產抗生素能力很弱或者不產抗生素。放線菌因為生殖上的劣勢，不得不通過產生抗生素來對抗快速繁殖的微生物，以獲取對自身有利的營養物質和生存空間，窖泥中的微生物經過長期的馴化，群落之間形成了穩定的生態環境，在這一穩定生態系統中被選擇出的放線菌無需產生抗生素也能良好的生長。

圖9 兩株放線菌產抗生素抑菌性實驗

2.4.5 放線菌株產淀粉酶特性

有研究表明[15-16]，放線菌具有較高的酶活力，且能夠利用淀粉酶分解淀粉產生葡萄糖，與此同時，窖泥中的產己酸菌可以利用放線菌產生的葡萄糖產生己酸，從而提高己酸產量?；诖吮狙芯糠謩e對兩株菌進行了產淀粉酶能力測定實驗，通過觀察分解圈的有無和大小研究兩株菌產淀粉酶能力強弱。結果如圖10 所示，兩株菌所在平板均能觀察到分解圈，且菌株X 所在平板的分解圈明顯大于菌株Z，表明菌株X 和菌株Z 均能夠產生淀粉酶，且菌株X 的產淀粉酶能力更強。結果表明窖泥中放線菌能夠分解淀粉，為其他菌株的生長提供營養物質。

圖10 兩株放線菌的淀粉分解試驗

3 討論

本研究通過對窖泥預處理并選擇合適抑制劑的方法，自濃香型白酒窖泥樣品中篩選分離獲得放線菌X 和放線菌Z，并對兩株放線菌進行多項分類鑒定，以及生理代謝特性研究。結果表明，兩株放線菌在實驗室條件下培養可正常生長，并產生大量孢子。通過PCR 測序以及系統發育樹的建立，結合《伯杰氏細菌鑒定手冊》，確定X 菌株屬于產灰鏈霉菌（Streptomyces griseus），Z 菌株屬于德氏鏈霉菌（Streptomyces drozdowiczii）。通過對兩株放線菌的生長進行跟蹤發現，兩株放線菌生長發育基本同步，生長曲線均在12～48 h 時間段內呈幾何級數增長，進入對數期生長階段，并在48 h 后進入穩定期和衰亡期。兩株菌的繁殖隨著溫度的升高均呈現出先增高后降低的趨勢，且最適生長溫度區間在25～30 ℃，兩株放線菌最適生長酸度為pH6.5，菌株X 在酒精度10 %vol 時不耐受，菌株Z 在酒精度8 %vol 時不耐受。菌株X 和菌株Z 均能夠產生淀粉酶，表明放線菌可以分解淀粉為其他有利菌的生長提供葡萄糖，從而影響白酒風味。菌株X 和菌株Z 均未產生抗生素，表明在這一穩定生態系統中被選擇出的放線菌無需產生抗生素也能良好的生長。