一株嗜熱脂肪芽孢桿菌的篩選及其產酶特性研究

張運祺，鄭自強，邢浩博，應超，蘭茂華，任志強，2，衛春會，2*

（1.四川輕化工大學釀酒生物技術及應用四川省重點實驗室，四川宜賓 644000；2.中國輕工業釀酒生物技術及智能制造重點實驗室，四川宜賓 644000）

白酒釀造離不開曲，曲的品質影響白酒的酒質和酒體風格，按制曲溫度可分為低溫曲、中溫曲、中高溫曲和高溫曲[1]。因高溫制曲工藝更能增加曲香，白酒企業青睞于使用中高、高溫曲釀造名優酒，在高溫釀造環境中，細菌尤其是嗜熱芽孢桿菌經環境篩選成為優勢菌群[2-3]。嗜熱芽孢桿菌能夠代謝香味物質，分泌纖維素酶、淀粉酶和蛋白酶等多種功能酶，是中高溫和高溫曲內的重要微生物，其作用主要突出表現在將淀粉和蛋白質降解為氨基酸和可發酵性糖，嗜熱芽孢桿菌的發酵特性與制曲的“三高”工藝匹配，優良嗜熱芽孢桿菌的篩選與應用成為行業內提高酒曲品質的重要研究方向[4-5]。

近年來，隨著經濟迅速發展，提高優質酒率需求逐漸增加，釀造優質酒所用的高溫曲品質備受關注，大曲功能芽孢桿菌微生物相關報道屢見不鮮。張立強[6]從大曲中分離篩選得到2 株纖溶酶活力較高的貝萊斯芽孢桿菌（Bacilus velezensis）和地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis），其能夠合成活性肽、地衣素和吡嗪類化合物等多種生理活性物質；劉曉昆[7]研究了高溫大曲中10 株產淀粉酶、蛋白酶的細菌菌株,確定其中8 株為貝萊斯芽孢桿菌(Bacillus velezensis)，2 株為枯草芽孢桿菌枯草亞種(Bacillus subtilis subsp.subtilis)，為揭示大曲功能微生物及其作用、增強白酒風味、提高白酒產量提供了數據參考；馮利芳[8]從清香大曲中篩選出1 株高產中性蛋白酶的短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)，經制曲應用，強化大曲的糖化力提高了13.7 %，液化力提高了125 %，中性蛋白酶活提高了101.5 %，酸性蛋白酶活提高了7.65 倍。雖然大曲中芽孢桿菌微生物的資源利用受到學者關注，但在高溫極端制曲環境中可發揮良好產酶功能的嗜熱菌研究尚有不足。

本研究以高溫大曲為菌源，篩選具有產淀粉酶和蛋白酶功能的嗜熱芽孢桿菌，經生理生化鑒定和分子鑒定確定其種屬關系，對其生長特性和產酶特性進行研究，并用于強化大曲探究其功能特征，以期為高溫曲的優化應用提供參考價值。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

1.1.1 材料

高溫大曲取自川北某濃香型酒廠（頂溫約為62 ℃），取樣后粉碎均勻混合分裝于密封袋，4 ℃保存；麩皮、高粱為市售。

1.1.2 試劑

3，5-二硝基水楊酸（化學純）、磷酸二氫鉀、可溶性淀粉（分析純），成都市科隆化學品有限公司；三氯乙酸、溴百里香酚藍、羧甲基纖維素鈉（分析純），成都市科龍化工試劑廠。

1.1.3 儀器設備

SW-CJ-IF 超凈工作臺，蘇州凈化有限公司；TC1000-G PCR 擴增儀，上海歡奧科技有限公司；MicroSreen HT 實時微生物生長曲線分析儀，杰靈儀器制造天津有限公司；A360 紫外可見光光度計，上海翱藝儀器有限公司；ChemiDocXRS+化學發光成像系統，日本SONY 公司。

1.1.4 培養基

LB 培養基：酵母浸粉5 g/L，胰蛋白胨10 g/L，氯化鈉10 g/L。（固體培養基添加瓊脂粉15 g/L。）

淀粉固體培養基：可溶性淀粉10 g/L，牛肉膏0.9 g/L，蛋白胨3 g/L，氯化鈉1.5 g/L，瓊脂15 g/L，pH7.0。

酪素固體培養基：干酪素10 g/L，牛肉膏3 g/L，氯化鈉5 g/L，磷酸氫二鉀2 g/L，溴百里香酚藍0.05 g/L，瓊脂15 g/L，pH7.0。

羧甲基纖維素鈉固體培養基：羧甲基纖維素10 g/L，蛋白胨2 g/L，七水合硫酸亞鐵0.01 g/L，氯化鈉0.5 g/L，瓊脂15 g/L，pH7.0。

1.2 試驗方法

1.2.1 嗜熱芽孢桿菌的富集

無菌條件取大曲樣品5.0 g 于145 mL 無菌生理鹽水中，置于120 r/min 搖床30 min，隨后置于80 ℃水浴鍋中水浴處理1 h，取菌懸液5 mL 接入滅菌冷卻后的LB 液體培養基，接種量為5 %（v/v），培養溫度為60 ℃，于120 r/min 搖床內培養24 h，為富集液[8]。

1.2.2 嗜熱芽孢桿菌的篩選

（1）初篩。取富集液在超凈工作臺內用LB 固體培養基適宜梯度下稀釋涂布，60 ℃倒置培養24 h，分別挑取形態不同的單菌落于LB 固體培養基相同條件下劃線倒置培養24 h。

（2）復篩。挑取劃線后生長出的單菌落接入滅菌后的LB 液體培養基中，60 ℃培養24 h，轉接一次，為種子液，取種子液裝入25%甘油管，-80 ℃儲藏備用；挑取單菌落點植于淀粉培養基、酪素培養基和羧甲基纖維素鈉培養基上，50 ℃培養48 h 后觀察透明圈的大小，測量并計算透明圈直徑(D)和菌落直徑(d)的比值(D/d)，篩選產酶能力較強的菌株。

淀粉酶培養基透明圈的觀察采用碘液染色法[9]；蛋白酶培養基透明圈直接觀察；纖維素酶培養基透明圈的觀察采用剛果紅染色法[10]。

1.2.3 嗜熱芽孢桿菌的形態學鑒定

取種子液于LB 固體培養基適宜梯度下稀釋涂布培養24 h，培養溫度為60 ℃，觀察菌落形態特征情況，并拍照記錄。

1.2.4 嗜熱芽孢桿菌的分子生物學鑒定

取種子液提取細菌DNA，使用Takara 試劑盒提取細菌DNA，操作步驟為試劑盒步驟。

PCR 引物[11]：正向引物為27F (5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCA-3')，反向引物為1492R(5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3')。

PCR 體系：27F 引物1 μL、1492R 引物1 μL、MIX 酶12.5μL、DNA 模板1μL、ddH2O 9.5μL。

PCR條件：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性1 min，50 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，72 ℃補充延伸10 min，循環30 次。

將擴增產物進行電泳，于凝膠色譜成像儀下觀察擴增結果。將擴增結果好的引物送至上海生物公司測序，測序結果在NCBI 中的Gen Bank 數據庫進行同源性比對分析，利用MEGA7.0 軟件建樹確定菌種。

1.2.5 測定方法

1.2.5.1 嗜熱芽孢桿菌的生長特性分析

（1）生長曲線測定。配制LB 液體培養基，滅菌后按接種量為1%（v/v）接入種子液，180 r/min 搖床內40 ℃溫度下培養24 h，空白組為未接種的培養基。每隔1 h 取適量菌液，測定發酵液的OD600nm值，繪制生長曲線。

（2）生長特性測定。配制LB 液體培養基，分別設置在不同初始pH 值（3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0）、不同NaCl 濃度(0 %、2 %、4 %、6 %、8 %、10 %、12 %，濃度單位為m/v)、不同乙醇體積分數（0 %、2 %、4 %、6 %、8 %、10 %、12 %）以及不同溫度（35 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃、60 ℃、65 ℃、70 ℃）下培養種子液，測定發酵液的OD600nm值，探究嗜熱芽孢桿菌不同條件下的生長情況。

1.2.5.2 嗜熱芽孢桿菌的產酶特性分析

將菌株單菌落以2 %(v/v)的接種量接入LB培養基，55 ℃、180 r/min 振蕩培養。取發酵液5000 r/min 離心10 min，上清液作為粗酶液[12]。蛋白酶酶活力的測定方法采用福林酚法[13]；淀粉酶酶活力的測定方法采用3，5-二硝基水楊酸（DNS）法[14]。

蛋白酶活力單位：在55 ℃、pH7.0 的條件下，水解酪素1 min 產生1 μ g 酪氨酸作為一個酶活力單位，用U 來表示。

淀粉酶活力單位：在55 ℃、pH7.0 的條件下，以每分鐘水解底物可溶性淀粉生成1 μ mol 還原糖（以葡萄糖計）所需酶的量作為一個酶活力單位（U）。

1.2.5.3 嗜熱芽孢桿菌強化麩曲應用

參考傳統麩曲制作工藝，制作淺盤麩曲，以磚狀金屬盒為模具，取100 g 麩皮和10 g 麥粉混勻，4 層紗布封口，121 ℃滅菌20 min，烘干備用；取10 mL種子液高速離心集菌，用無菌水將菌體接種至麩皮麥粉中作為實驗組，以直接添加等量無菌水的為空白組，拌勻封口，37 ℃恒溫培養3 天后烘干備用[15-17]。

1.2.5.4 數據處理

結果均采用x±Sd 的形式表示，SPSS 19.0 數據進行顯著性分析，Excel 和origin 軟件進行圖表制作；采用DNAstar 進行DNA 序列修剪，通過NCBI數據網站進行同源性比較，使用MEGA 7.0 軟件構建系統發育樹。

2 結果與分析

2.1 嗜熱芽孢桿菌初篩和復篩結果分析

選擇初篩后的菌種經劃線純化，得到單菌落，結合革蘭氏染色鏡檢觀察菌落形態特征，并將分離出的純種菌株點植到淀粉培養基、酪素培養基和羧甲基纖維素鈉培養基上。結果表明，得到1 株具有良好產淀粉酶和蛋白酶能力的嗜熱芽孢桿菌，命名為ZJY-1，其菌落特征、鏡檢及透明圈復篩結果見圖1。由圖1 可知，菌株ZJY-1 的菌落緊貼培養基生長，呈扁平狀，白色，菌落不透明，暗沉，表面干燥，菌落邊緣不整齊；通過鏡檢觀察，菌體呈桿狀，革蘭氏染色呈紫色；3種培養基復篩后，菌株ZJY-1 淀粉酶透明圈直徑為1.50 cm，菌落直徑為0.30 cm，直徑比為5.00，蛋白酶透明圈直徑為1.70 cm，菌落直徑為0.60 cm，直徑比為2.83，纖維素酶篩選培養基上無透明圈產生。

圖1 ZJY-1 菌落特征、鏡檢及透明圈復篩結果

綜合上述結果，參照《伯杰氏細菌鑒定手冊》[18]，初步確定菌株ZJY-1 為具備一定產淀粉酶和蛋白酶能力的嗜熱革蘭氏陽性芽孢桿菌。

2.2 嗜熱芽孢桿菌的分子生物學鑒定結果分析

為進一步確定菌株ZJY-1 的種屬關系，提取菌株ZJY-1 的DNA，通過PCR 擴增后進行凝膠電泳觀察條帶，將合格的PCR 產物進行測序，基于16S rDNA 基因序列菌株ZJY-1 的系統發育樹見圖2。由圖2 可知，菌株ZJY-1 與土芽孢桿菌屬Geobacillus高度相關，且與嗜熱脂肪芽孢桿菌（Geobacillus stearothermophilus strain）S2M(KJ722527)聚為同一支，其同源性為100.00 %，建樹結果表明菌株ZJY-1 為嗜熱脂肪芽孢桿菌。

綜合菌落特征、鏡檢及分子生物學結果，確定菌株ZJY-1 為土芽孢桿菌屬的嗜熱脂肪芽孢桿菌。

2.3 菌株ZJY-1 的生長曲線測定

掌握細菌生長規律有助于研究其生理和生產實踐。本試驗對菌株ZJY-1 的生長曲線測定結果如圖3 所示，可看出菌株ZJY-1 在0～5 h 時，菌體生長緩慢，處于停滯期，在6～16 h 時，菌株生長迅速，為對數期，在16～20 h 時生長更為緩慢，為平穩期，21 h 后菌株ZJY-1 進入衰亡期。

2.4 嗜熱芽孢桿菌的生長特性分析

圖2 基于16S rDNA 基因序列菌株ZJY-1 的系統發育樹

圖3 菌株ZJY-1 的生長曲線測定分析

菌株應用方向主要為白酒制曲環境，環境差異會直接影響微生物的新陳代謝活動[19]。為將菌株ZJY-1 用于生產應用，本文在不同的pH 值、溫度、NaCl 濃度及乙醇濃度下進一步考察了菌株ZJY-1的生長特性，結果如圖4 所示。

pH 影響了細菌分泌酶的表達，適宜的pH 值條件可保證芽孢桿菌生命活動正常進行（圖4a），菌株ZJY-1 隨著培養初始pH 值的增加生長更加旺盛，并在初始pH7.0 時生長最好，當初始pH 值繼續增加至偏堿性時，生長狀況下降。秦立芹[20]從醬香型白酒釀造環境中篩選得到1 株產淀粉酶的細菌，發現其在pH5～9 范圍內生長良好。結果表明，中性環境更適宜菌株ZJY-1 的生長。

圖4 菌株ZJY-1 的生長特性測定分析

圖5 菌株ZJY-1 的產酶特性測定分析

芽孢桿菌可生成芽孢，嗜熱菌對高溫環境有著更強的適應能力，但過高的溫度會影響功能酶的表達，降低細胞代謝能力（圖4b），隨著培養溫度的增加，菌株ZJY-1 菌體濃度增加，對高溫表現出良好的應激性，在培養溫度為55 ℃時生長最為旺盛，OD600值此時最高，達到了0.85，隨著培養溫度繼續升高，細菌生命活動受到抑制，但在65 ℃時依舊可存活，當培養溫度到達70 ℃時，菌株ZJY-1 基本停止生命活動，結果表明，菌株ZJY-1 有良好的嗜熱性，在50～65 ℃范圍內皆可生長旺盛。

鹽濃度與乙醇濃度常作為微生物生長特性的考察因素，其改變了培養環境的滲透壓和細胞膜的吸收，高鹽濃度會導致細菌失水死亡，高乙醇濃度會給細菌帶來毒害作用從而失活[21]。由圖4 可知（圖4c、圖4d），菌株ZJY-1 的最高耐受NaCl 濃度為4%，超過4%時菌株趨近死亡，最高乙醇耐受濃度為4 %，在6 %濃度及更高濃度下細菌停止代謝。結果表明，菌株ZJY-1 對于環境鹽濃度和乙醇濃度耐受表征接近大多數細菌，但并未表征出優良的NaCl 鹽和乙醇耐受性。

2.5 嗜熱芽孢桿菌的產酶特性分析

通過前期試驗，菌株ZJY-1 可能同時具備產蛋白酶和淀粉酶能力，大曲中的細菌微生物主要表達淀粉酶和蛋白酶，為進一步了解其產酶特性，在適宜條件下，每隔12 h 測定淀粉酶活和蛋白酶活，在不同發酵時間段酶活力測定結果如圖5 所示，隨著發酵時間的延長，菌株ZJY-1 蛋白酶和淀粉酶的活力呈先增加后下降趨勢，菌株的蛋白酶酶活在36 h時達到最高，達到了181.8 U/g±8.3 U/g，淀粉酶酶活在24 h 達到最高，最高達137.6 U/g±5.1 U/g，隨后隨發酵時間延長酶活顯著降低，當發酵時間到48 h時達到較低值，淀粉酶活僅有32.5 U/g±3.1 U/g，蛋白酶約為27.3 U/g±7.1 U/g。

2.6 嗜熱芽孢桿菌強化麩曲應用

為初步探究菌株ZJY-1 應用于曲的產酶能力，以菌株ZJY-1 為菌源制備種子液，接入麩皮培養基制備嗜熱芽孢桿菌麩曲，測定其麩曲生物量和功能酶活力，考察ZJY-1 強化麩曲酶活力和生物量指標，結果如表1 所示，以菌株ZJY-1 為菌源制備的強化麩曲仍可保持較高的酶活力，淀粉酶活為133.5 U/g±12.5 U/g，蛋白酶活達到了175.4 U/g±4.8 U/g；對其生物量進行檢測，結果發現，ZJY-1 強化麩曲的生物量指標較高，達到了5.7×1010±2.8×109CFU/g，高于市售麩曲生物量指標，菌株ZJY-1表現出了優異的產淀粉酶和蛋白酶能力，發揮其酶活性功能的前提下，生物量指標突出，可用于強化麩曲擴培。

3 結論

本課題以優化高溫大曲發展為背景，從高溫大曲中篩選芽孢桿菌，并初步探究了菌株應用于強化曲的價值，結果如下：

表1 ZJY-1 強化麩曲酶活及生物量測定分析

從高溫大曲中篩選出了1 株嗜熱菌株ZJY-1，鑒定為嗜熱脂肪芽孢桿菌（Geobacillus stearothermophilus strain），菌株具備產淀粉酶和蛋白酶能力，分析其生長特性發現菌株鹽耐受和乙醇耐受能力為芽孢桿菌普遍耐受范圍，適宜生長在中性pH值環境，在65 ℃高溫環境下仍長勢良好；在不同發酵時間下進行酶活力檢測，其淀粉酶活力最高為133.5 U/g±12.5 U/g，蛋白酶活力最高為175.4 U/g±4.8 U/g；以菌株ZJY-1 為菌源制備強化麩曲，ZJY-1麩曲具有良好產蛋白酶和淀粉酶能力，且生物量指標較高，可達到5.7×1010±2.8×109CFU/g。

本研究突破了高溫大曲菌種應用中的不耐高溫、功能酶活性不足、菌種生物量低等難點，豐富了高溫大曲功能菌資源，為高溫曲優化提供了一定的理論基礎和科學指導。