荊防顆粒揮發油β-環糊精制備工藝的優化

曹玲 李因坤 崔琳琳 高艷紅 姜佳峰

荊防顆粒具有發汗解表、散風祛寒的功效[1],處方中的荊芥、防風、羌活、獨活、川芎、枳殼、前胡中含有揮發油成分,經現代藥理學實驗證明具有解熱、鎮痛、抗炎、抗病毒等多種藥理作用,是發揮藥效的主成分[2-3]。但揮發油具有易揮發、有效成分穩定性差、易氧化變質及氣味濃烈等特點,不便于貯存和使用,若在制劑過程中直接加入,易吸附于器具上,不僅降低利用率,成藥性也較差[4-5]。經研究發現,揮發油經β-環糊精包合后,使液態油變成固體粉末的包合物,便于制劑,還可避免揮發油揮發,提高了穩定性。此外經β-環糊精包合后揮發油在水中溶解度增加,具有緩釋作用,其生物利用度大大提高[6-7]。因此,本研究擬通過對比不同揮發油包合方法,以探尋荊防顆粒揮發油β-環糊精包合物最佳制備工藝。

1 儀器與試藥

1.1儀器

GC-2030型高效氣相色譜儀(美國島津公司);MS1003TS/02型電子天平[梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司];膠體磨(溫州市膠體磨廠)。

1.2試藥

荊芥(批號:200928)、防風(批號:202105)、羌活(批號:200701)、獨活(批號:63120001)、川芎(批號:456221002)、枳殼(批號:200927)、前胡(批號:200927)藥材(中藥制藥共性技術國家重點實驗室,經高艷紅主任鑒定為正品);β-環糊精(批號:20210706,孟州市華興生物化工有限責任公司);甲醇(批號:20035159)、乙腈(批號:20115187)為色譜純(美國天地有限公司);其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1荊防顆粒揮發油的提取

荊防顆粒揮發油A的提取:按照荊防顆粒制法項下,按處方比例稱取川芎、枳殼藥材飲片,投入多功能提取罐中,加入6倍量水,采用水蒸氣蒸餾法提取揮發油,收集揮發油置冷庫中貯存備用。

荊防顆粒揮發油B的提取:按照荊防顆粒制法項下,按處方比例稱取羌活、獨活、荊芥、防風、前胡藥材飲片,投入多功能提取罐中,加入6倍量水,采用水蒸氣蒸餾法提取揮發油,收集揮發油置冷庫中貯存備用。

2.2揮發油空白回收率的測定與評價指標計算方法

按《中華人民共和國藥典》2020年版四部通則“2204揮發油測定法”項下方法[8]測定混合(A+B)揮發油的空白回收率,平行操作三次,得到平均空白回收率為92.63%。

×100%

×100%

2.3不同包合方法對揮發油包合率和包合物得率影響

以揮發油包合率和包合物得率為考察指標,比較膠體磨法、飽和水溶液法、超聲法對揮發油包合工藝的影響,優選出最佳包合方法。

2.3.1 膠體磨法 量取揮發油A、B各10 mL,混合均勻,共3份,加入20 mL無水乙醇,制成混合40 mL揮發油無水乙醇溶液。稱取120 g β-環糊精,加入360 mL水使其成溶解,倒入膠體磨中擠壓攪拌,同時緩慢滴加混合揮發油無水乙醇溶液,包合一定時間后,放出包合物,冷藏24小時,抽濾,濾渣用石油醚洗滌,40℃干燥,稱重,計算包合物得率。稱取包合物6 g,置500 mL圓底燒瓶中,加入蒸餾水300 mL,連接揮發油提取器,按《中華人民共和國藥典》2020年版四部通則方法“2204揮發油測定法”項下方法提取揮發油,計算包合率。結果見表1。

表1 不同包合工藝對揮發油包合率和包合物得率的影響

2.3.2 飽和水溶液法 采用磁力加熱攪拌器,分別稱取120 g β-環糊精,共3份,各加360 mL水,加熱攪拌溶解制成飽和溶液,當溫度降至40℃,精密吸取40 mL揮發油無水乙醇溶液(配制方法同2.3.1),加至β-環糊精飽和溶液中,以恒溫40℃,500 r/min攪拌一定時間,冷藏24小時,抽濾,濾渣用石油醚洗滌,于40℃干燥,稱重,計算包合物得率。按上述2.3.1項從“稱取包合物6 g”開始操作。結果見表1。

2.3.3 超聲法 分別稱取120 g β-環糊精,共3份,各加360 mL水,加熱攪拌溶解制成飽和溶液,當溫度降至40℃時,精密吸取40 mL揮發油無水乙醇溶液(配制方法同2.3.1),加至β-環糊精飽和溶液中,以40℃、30 Hz超聲頻率包合一定時間,冷藏24小時,抽濾,濾渣用石油醚洗滌,于40℃干燥,稱重,計算包合物得率。按上述2.3.1項從“稱取包合物6 g”開始操作。結果見表1。

由表1可知,膠體磨法得到的包合物揮發油包合率和包合物得率均高于其他2種方法,因此確定采用膠體磨法包合荊防顆粒揮發油。

2.4包合工藝優化

2.4.1 綜合評分計算方法 包合率是考察揮發油包合程度的重要指標,而包合物得率反映實際產率。因此以揮發油包合率和包合物得率的綜合評分(Y)為評價指標,使用SPSS 22.0的熵值法進行計算,Y中包合率(Y1)的權重系數為75.93%,包合物得率(Y2)的權重系數為24.07%。

2.4.2 單因素實驗 (1)考察揮發油與β-環糊精比例:固定β-環糊精∶水為1∶3,包合時間20分鐘,考察荊防顆粒揮發油與β-環糊精的比例對綜合評分(Y)的影響,試驗結果見圖1。結果顯示荊防顆粒揮發油與β-環糊精的投料比在1∶4～1∶12時,隨著投料比的增加,Y先增加,于1∶8時達到最高值后略有降低。因此,選擇投料比1∶6～1∶10進行后續實驗。

圖1 揮發油與β-環糊精比例對膠體磨法包合揮發油的影響

(2)考察β-環糊精與水的比例:固定荊防顆粒揮發油∶β-環糊精為1∶8,包合時間20分鐘,考察β-環糊精與水的比例對Y的影響,試驗結果見圖2。隨著用水量的增大,Y先增加,于1∶3時達到最高值后略有降低,故選擇β-環糊精與水的比例在1∶2～1∶4進行后續實驗。

圖2 β-環糊精與水比例對膠體磨法包合揮發油的影響

(3)考察研磨包合時間:固定荊防顆粒揮發油∶β-環糊精為1∶8,β-環糊精∶水為1∶3,考察包合時間對Y的影響,試驗結果見圖3。隨著包合時間的延長,Y先迅速增加,當包合時間為20分鐘時增速減緩,當包合時間為25分鐘時Y趨于穩定,故選擇包合時間為15～25分鐘進行后續Box-Behnken響應面優化。

圖3 研磨包合時間對膠體磨法包合揮發油的影響

2.4.3 響應面優化Box-Behnken試驗設計和結果 根據Box-Behnken設計原理,以揮發油:β-環糊精(A)、β-環糊精:水的比例(B)和包合時間(C)為考察因素,以Y為響應值,設計Box-Behnken試驗。試驗設計及結果見表2,方差結果分析見表3。方差分析結果如表3所示,建立的回歸整體模型其F值為36.05,P<0.01,說明模型極顯著;失擬項P>0.01,無統計學差異,說明非試驗因素對試驗結果影響不大,模型成立。二次多項回歸方程為Y=87.96+3.58A+2.59B+2.25C-1.00AB+0.42AC+1.16BC-13.93A2-8.42B2-8.04C2,R2=0.9517>0.9,說明模型與試驗結果擬合較好。對綜合評價指標Y來說,其中A(揮發油:β-環糊精)綜合評分有極顯著影響(P<0.01),B(β-環糊精:水)和C(包合時間)對綜合評分有顯著性影響(P<0.05)。A2、B2、C2三個因素均達到極顯著水平(P<0.01)。各因素的影響順序為A>B>C,三個因素對Y的交互影響分別見圖4～6。

圖4 因素揮發油∶β-環糊精、β-環糊精∶水對膠體磨法包合揮發油效果的影響

圖6 因素β-環糊精∶水、時間對膠體磨法包合揮發油效果的影響

表2 Box-Behnken響應面實驗設計及結果

表3 響應面二次回歸方程方差分析結果

2.4.4 驗證實驗 利用Design-Expert v10.0.7軟件求得Y最優解為荊防顆粒揮發油∶β-環糊精為1∶8.25,β-環糊精∶水為1∶3.16,研磨包合時間為20.76分鐘,在此條件下計算的綜合評分為88.56。

為方便車間生產實際操作,最優工藝條件修正為荊防顆粒揮發油∶β-環糊精為1∶8,β-環糊精∶水為1∶3,研磨包合時間為21分鐘。按此條件對包合工藝進行三次驗證試驗,結果揮發油包合率平均為85.98%,包合物得率平均為92.51%,綜合評分為87.43,相對標準偏差為1.94%。結果表明,優化的揮發油包合工藝參數重復率好,穩定可行。

2.5荊防顆粒揮發油包合前后氣相色譜法檢測

荊防顆粒揮發油包合物用3倍體積石油醚洗滌3次,晾干, 精密稱取適量晾干后的包合物, 置于容量瓶中,加適量無水乙醇,超聲30分鐘脫包,定容至刻度,濾過,取續濾液,用乙醇稀釋后進樣。色譜柱:DB-624UI,進樣口溫度:250℃;分流比:1∶20;進樣量:1 μL;柱溫:100℃保持2分鐘,10℃/分鐘升溫至140℃,保持2分鐘,4℃/分鐘升溫至180℃,保持2分鐘,20℃/分鐘升溫至250℃,保持5分鐘;流速:1 mL/分鐘;FID:300℃,結果見圖7。結果顯示包合前后揮發油化學成分保持不變。

注:1 揮發油;2 包合物。

3 結論

荊防顆粒處方中含有的羌活、獨活、荊芥、防風、川芎等幾味中藥,揮發油為其發揮藥效的主要有效成分。常用的揮發油包合方法有飽和水溶液法、超聲法、膠體磨法等。本實驗通過對這3種包合方法的比較,發現飽和水溶液法制備揮發油包合物,β-環糊精用量大,包合過程需要全程保溫,能耗較大,操作繁瑣,不利于工業生產。超聲法制備揮發油包合物時,飽和溶液超聲冷卻后容易形成結晶析出,溶液表面有油滴,包合效果較差,包合率明顯低于飽和水溶液法和膠體磨法。而膠體磨法制備揮發油包合物揮發油利用率高、包合時間短、操作簡便,占用空間小、設備投入少,適合工業大量生產[9-11]。

工藝優化方法應用最多的是正交設計和均勻設計,缺乏實驗精確度,各因素交互作用考察不靈敏,建立的數學模型預測性差。而本研究采用Box-Behnken設計—響應面法,通過多元二次回歸方程擬合各因素與響應值之間的函數關系,數學模型預測性好,能夠準確表示試驗設計與優化結果,實驗精確度較高。

因此,本實驗使用膠體磨法包合荊防顆粒揮發油,并采用Box-Behnken設計—響應面法優選得到揮發油包合的最佳工藝,結果表明,優選的包合工藝穩定可行,揮發油包合率和包合物得率均較高,分別為85.98%和92.51%,這為荊防顆粒發揮療效奠定基礎。