冷藏期內紅陽獼猴桃軟腐病病原菌的分離與鑒定

凌立貞 陳林燕 涂丹丹 張書東

摘要 為明確導致貯藏期紅陽獼猴桃果實軟腐的病原菌種類，本研究以冷藏期紅陽獼猴桃病果為試材，采用組織塊分離法分離軟腐病病原菌，按照科赫法則確定分離病株的致病性，同時采用形態學結合分子鑒定技術對病原菌種類進行鑒定。結果表明，共有4種軟腐病病原菌被鑒定，分別是擬莖點霉菌（Phomopsis sp.）、間座殼菌（Diaporthe sp.）、互隔鏈格孢菌（Alternaria alternata）和細極鏈格孢菌（A. tenuissima）。上述4種病原菌是新鑒定的冷藏期紅陽獼猴桃果實軟腐病的病原菌，其中細極鏈格孢菌作為獼猴桃果實軟腐病病原菌被首次報道。

關鍵詞 紅陽獼猴桃；軟腐病；病原菌；冷藏期

中圖分類號 S436.634.1+1? ?文獻標識碼 A

文章編號 1007-7731（2023）06-0114-05

Abstract The pathogens were isolated from the decayed Hongyang kiwifruit during cold storage by tissue isolation method followed by Koch's postulates pathogenicity test. In this study， phenotypic and molecular techniques were applied to characterize the causal agents of Hongyang kiwifruit rot. Results showed a total of four pathogenic fungi were identified， including Phomopsis sp.， Diaporthe sp.， Alternaria alternata and A. tenuissima， which became the new pathogens of Hongyang kiwifruit during storage. Especially， this is the first proof that A. tenuissima as the causal agents can cause the decay of kiwifruit.

Keywords Hongyang kiwifruit; fruit rot; pathogen; cold storage

紅陽獼猴桃（Hongyang kiwifruit）為獼猴桃科（Actinidiaceae）獼猴桃屬（Actinidia）多年生木質藤本植物，是我國選育出的首個紅肉型中華獼猴桃（Actinidia chinensis var. rufopulpa）品種，目前已被列為國家級品種保護資源[1]。紅陽獼猴桃具有豐富的營養成分，每100 g鮮果肉中含維生素C約350 mg，含量是蘋果的100倍，被譽為“維C之王”[2]；鮮果富含稀有天然維生素E、17種游離氨基酸和多種礦物質成分，具有抗癌、抗肝損傷、抗病毒和抗衰老等醫療保健作用[3-4]。另外，紅陽獼猴桃因其果實較大，果形整齊，果心鮮紅色，肉質細嫩，口感鮮美而備受青睞。近年來種植面積在國內外迅速擴大，四川和貴州是我國紅陽獼猴桃的主產區，其產量已躍居世界前列。

然而，紅陽獼猴桃果實在采后貯藏過程中極易腐爛，嚴重影響其口感和品質[5-6]。研究表明，紅陽獼猴桃果實采后易腐爛，主要是由自身的呼吸生理狀況（如呼吸強度、乙烯釋放速率）和外界因素共同影響的。一方面，紅陽獼猴桃屬于呼吸躍變型果實，在貯藏過程中呼吸高峰出現后就進入了衰亡階段，此時已經喪失了保鮮價值；另一方面，紅陽獼猴桃果實皮薄多汁、含糖量高，容易受到病原菌的侵染。紅陽獼猴桃果實在采集前后均可遭受病原菌的侵染[3，7]。采集前的侵染通常是病原菌在果實生長時期侵入其內部，直至成熟時才開始出現癥狀；采集后的侵染主要是病原菌的孢子寄生在果實表面，當環境條件適宜時萌發并通過傷口或皮孔侵入果實內部后引發發病。

軟腐病又稱熟腐病，是貯藏期紅陽獼猴桃果實腐爛的主要病害之一[3，8-10]。它是由真菌通過傷口侵入果實內部而引起的，其發病率高達50%，給獼猴桃產業造成了巨大的經濟損失[11-15]。雷霽卿和潘慧等[7-8，16]通過調查研究多個果園內的紅陽獼猴桃病果，發現導致軟腐病的病原菌種類很多，主要有擬莖點霉菌（Phomopsis sp.）、間座殼菌（Diaporthe sp.）、葡萄座腔菌（Botryosphaeria dothidea）、小新殼梭孢菌（Neofusicoccum parvum）、擬盤多毛孢（Pestalotiopsis sp.）和互隔鏈格孢菌（Alternaria alternata）。目前，在采后或貯藏期的紅陽獼猴桃上發現的軟腐病病原菌種類較少，僅B. dothidea被報道[9，17]。但在海沃德、華優和徐香等其他品種的貯藏期果實中已鑒定出5種軟腐病病原菌[18]：多變根毛霉菌Mucor irregularis（Rhizomucor variabilis）、黑斑病菌（Alternaria brassicae）、葡萄座腔菌、互隔鏈格孢菌、間座殼菌（Diaporthe eres）。本研究通過對冷藏期紅陽獼猴桃軟腐病病原菌的分離和鑒定，進一步明確引起軟腐病的病原菌種類，為探究貯藏期紅陽獼猴桃軟腐病的有效防治措施奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

從六盤水市水城縣一字河獼猴桃交易市場貯藏冷庫中收集具有典型軟腐病特征的紅陽獼猴桃病果作為試驗材料。

1.2 試驗方法

1.2.1 病原菌的分離和純化。采用常規組織分離培養法分離純化病原菌菌株。具體操作如下：①紅陽獼猴桃病斑及周圍的組織依次用75%乙醇和0.5%次氯酸鈉擦拭消毒；②用無菌手術刀在紅陽獼猴桃果實病健交界處切取3～5 mm的果肉組織，接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（PDA：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂15 g、蒸餾水1 000 mL）上進行培養，并定期觀察；③待出現菌落后挑取尖端菌絲于新的PDA培養基進行純化，直至獲得純菌株。每個樣本設置3個重復。

1.2.2 病原菌株培養及菌落特征觀察。純培養菌株的菌落形態特征記錄要點參照吳文能等[19]的方法。

1.2.3 病原菌株基因組DNA的提取。取適量培養基上的菌絲置于研缽，加入液氮研磨至粉狀，轉入1.5 mL 離心管中，加入0.6 mL pH 8.0 TE溶液，使菌體充分懸浮。依次加入不同的物質進行混勻和水浴（250 ?L 10% SDS；3 μL 20 ng/?L 蛋白酶K，37 ℃水浴1 h；150 ?L 5 mol/L NaCl；150 ?L 2% CTAB，65 ℃水浴20 min）。然后，室溫下12 000 rpm離心20 min，吸取上清液至新的1.5 mL離心管，加入等體積異丙醇，充分混勻，室溫放置30 min，12 000 rpm，4 ℃離心10 min后去上清液，倒置離心管瀝干。加750 ?L 70%乙醇，輕彈管壁使沉淀懸浮，12 000 rpm，4 ℃離心2 min收集沉淀。每管加入30 ?L純化水（水中加RNase）溶解沉淀，終濃度為10 ng/?L，備用。

1.2.4 病原菌株的分子鑒定。提取真菌基因組DNA后，采用通用引物ITS1（TCCGTAGGTGAACCTGCGG ）/ITS4（TCCTCCGCTTATTGATATGC）擴增真菌核糖體基因組轉錄間隔區（ITS）。采用引物H3-1a（ACTAAGCAGACCGCCCGCAGG）/H3-1b（GCGGG CGAGCTGGATGTCCTT）擴增histone3基因，進一步鑒定細極鏈格孢病原菌。擴增后的PCR產物送往華大基因公司進行兩端測序。獲取的序列用DNAMAN軟件進行拼接，得到的一致性序列與NCBI上已知的菌株序列進行Blast比對，作同源性分析。

1.2.5 病原菌菌株的致病性測定。接種不同物種的菌株于PDA平板上，在25 ℃條件下培養，待適齡后用打孔器取直徑為5 mm的菌餅；健康的紅陽獼猴桃果實進行表面消毒并用接種針刺傷果實，深度為2～3 mm；將菌餅的菌絲面緊貼于果實傷口處，放入透明盒中進行密封培養。定期觀察發病情況。以刺傷果實接種無菌PDA瓊脂塊為對照。每種處理設置3個生物學重復。

1.2.6 細級鏈格孢菌孢子的誘導及形態觀察。將細級鏈格孢菌的菌絲接種于玉米粉培養基（CMA：玉米粉6 g、葡萄糖6 g、瓊脂10 g，蒸餾水500 mL）上光照誘導培養6～8 h，后置于25 ℃恒溫培養箱中黑暗培養。培養14 d后產生分生孢子，挑取分生孢子至滅菌蒸餾水中，吸取少量孢子液于載玻片上，放置顯微鏡下進行觀察。

1.3 數據分析

采用Microsoft Excel 2003對試驗數據進行處理和統計分析。

2 結果與分析

2.1 病原菌的形態特征及致病性

從紅陽獼猴桃病果上分離純化得到68株菌株，根據其菌落形態特征可以劃分為4種類型。各類型病原菌代表菌株編號依次為P1-1w、Z1-1n、G1-1w和P1-2w，其菌落形態特征描述如下：

（1）Z1-1n菌株形態。菌落菌絲白色，呈棉絮狀，有同心輪紋，呈放射狀生長，生長速率10.0～12.5 mm/d，菌落邊緣不整齊，正面似玫瑰花紋，背面中部輪狀生長處有青色附著（圖1a）。

（2）G1-1w菌株形態。菌落菌絲潔白，呈棉絮狀，分布不均勻，有同心圓狀紋飾，呈放射狀生長，生長速率14.8～15.2 mm/d，生長較快，菌落邊緣不整齊，正面氣生菌絲少，中心菌絲稀疏，背面黃白色（圖1b）

（3）P1-1w菌株形態。菌落菌絲絨毛狀、致密，生長速率8.8～11.3 mm/d，呈放射狀生長，菌落邊緣不整齊，正面表面灰白色，背面中部黑褐色，邊緣棕色至灰白色（圖1c）。

（4）P1-2w菌株形態。菌落菌絲絨毛狀、致密，生長速率8.7～10.8 mm/d，呈放射狀生長，菌落邊緣不整齊，正面表面灰白色，背面中部黃褐色，邊緣棕色至灰白色（圖1d）。

致病性測定結果表明，4種類型代表菌株在刺傷接種后均可致病（圖2b-e），果實發病癥狀與自然發病癥狀一致。所有對照處理均無發病癥狀。對接種后發病果實的病斑進行再分離培養，均可得到與接種病原菌菌落特征一致的菌株。

2.2 病原菌的分子鑒定

擴增4種類型病原菌代表菌株的ITS序列，經測序拼接后得到大小約550 bp的序列。序列提交至NCBI數據庫，登錄號分別為P1-1w（ON165681）、P1-2w（ON165682）、Z1-1n（ON165683）和G1-1w（ON165685）。與GenBank已知序列進行同源性比對分析，結果表明：G1-1w和Z1-1n分別與擬莖點霉菌（Phomopsis sp.）和其有性型間座殼菌（Diaporthe sp.）的同源性較高，超過99.4%；而P1-1w和P1-2w分別與鏈格孢屬（Alternaria）的互隔鏈格孢（A. alternata）和細極鏈格孢（A. tenuissima）同源性均為100%（表1）。上述4種病原菌中擬莖點霉菌、間座殼菌和互隔鏈格孢菌作為采前紅陽獼猴桃軟腐病的病原菌均有被報道，但在貯藏期內作為紅陽獼猴桃軟腐病病原菌是首次被發現；其中細極鏈格孢菌不管是作為采前還是采后獼猴桃軟腐病病原菌還鮮見報道。

為進一步確定細極鏈格孢病原菌，觀察了其孢子形態（圖2f）：分生孢子倒棍棒狀或倒梨形、棕褐色，大小為（15～40）μm×（8.3～18.4）μm（n=30），有橫隔和縱隔。另外，測定了P1-2w的histone3片段序列（登錄號：MT210550），結果顯示，P1-2w與細極鏈格孢同源性為100%。根據形態特征和2個分子片段（ITS和histone3）序列，確定P1-2w為細極鏈格孢菌，該菌作為獼猴桃軟腐病病原菌首次被報道。

3 討論與結論

在貯藏期內，葡萄座腔菌是目前紅陽獼猴桃軟腐病報道的唯一一種病原菌[9，17]。該研究未分離出葡萄座腔菌，但分離鑒定出其他幾種病原菌：擬莖點霉菌、間座殼菌和2種鏈格孢菌（細極鏈格孢菌和互隔鏈格孢菌）。上述病原菌的鑒定對紅陽獼猴桃貯藏期軟腐病致病菌有了更深地認識，對軟腐病防治有重要意義。潘慧等[7]對六盤水市多個紅陽獼猴桃果園的調查發現，擬莖點霉菌、間座殼菌和互隔鏈格孢菌在多個果園病果中均有分離。因此，推測上述病原菌是在采前就潛伏在紅陽獼猴桃果實上，直至貯藏期才出現病癥。細極鏈格孢菌已被證實能夠引起獼猴桃葉片褐斑病[20]和果皮結痂[21]，但作為獼猴桃軟腐病病原菌在該研究中首次被報道。

潘慧等[7]對多個果園樣品軟腐病的鑒定發現，并非每個果園的致病菌均相同。劉娜等[22]研究表明，葡萄座腔菌在獼猴桃軟腐病的發病初期豐度有所變化，在發病后大面積腐爛時豐度減少。該研究未鑒定出葡萄座腔菌，一種原因可能是采樣點較少；另一種原因可能是采樣時期也有影響。除上述幾種軟腐病病原菌外，其他獼猴桃品種如海沃德、華優和徐香等的果實在貯藏過程中還鑒定出多變根毛霉菌和黑斑病菌[18]。綜上結果表明，貯藏期紅陽獼猴桃可能還有其他軟腐病病原菌未被分離鑒定，或者說獼猴桃軟腐病病原菌可能在不同品種間有所不同。該研究結果豐富了紅陽獼猴桃貯藏期軟腐病病原菌種類，其中細極鏈格孢菌作為獼猴桃軟腐病病原菌首次被報道。

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（責編：何 艷）

基金項目 貴州省科學技術基金資助項目［（黔科合基礎-ZK（2022）一般530］；六盤水市科技計劃項目（52020-2019-05-05）；六盤水師范學院大學生創新創業訓練計劃項目（S202010977036）。

作者簡介 凌立貞（1979—），女，博士。研究方向：植物學。