煙粉虱取食及其與TYLCCNV共侵染對煙草植株內H2O2的誘導響應

茹寧辰 姜珊 糾敏 汪倫記 任利娜

摘要 本研究采用DAB染色法定位檢測經煙粉虱取食及其與中國番茄黃化曲葉病毒（TYLCCNV）共侵染后煙草葉片中H2O2的積累，并定量分析煙草葉片中H2O2的含量。DAB染色結果表明，2種處理的煙草葉片中均未檢測到H2O2積累；H2O2的定量分析結果表明，2種處理均可誘導煙草葉片中H2O2含量較對照顯著升高。在煙粉虱取食處理后0.5、1、3、6、12 h及1、3、5、7、9 d，煙草葉片中H2O2含量分別為對照的1.62、1.71、1.77、1.77、1.95、1.46、1.82、1.63、1.53和1.08倍；共侵染處理后煙草葉片中H2O2含量分別為對照的1.64、1.84、1.95、2.19、2.29、1.43、2.17、2.08、2.60和1.79倍。煙粉虱與TYLCCNV共侵染較煙粉虱取食可誘導煙草植株內H2O2含量顯著升高。

關鍵詞 中國番茄黃化曲葉病毒；煙粉虱；煙草；活性氧；H2O2；誘導響應

中圖分類號 S572? ?文獻標識碼 A

文章編號 1007-7731（2023）06-0119-06

Abstract The accumulation of H2O2 in tobacco leaves was detected firstly by histochemical method after feeding of B. tabaci and its co-infection with TYLCCNV， and then the content of H2O2 in tobacco leaves was quantitatively analyzed. The results of DAB staining showed that no accumulation of H2O2 was detected in tobacco leaves after these two treatments. The quantitative analysis of H2O2 showed that the content of H2O2 in tobacco leaves increased significantly after these two treatments when compared with the control. At 0.5， 1， 3， 6， 12 h， and 1， 3， 5， 7， 9 d after feeding of B. tabaci， the contents of H2O2 in tobacco leaves were 1.62， 1.71， 1.77， 1.77， 1.95， 1.46， 1.82， 1.63， 1.53 and 1.08 times of that in the control leaves， respectively; while the contents of H2O2 in the tobacco leaves after co-infection with B. tabaci and TYLCCNV were 1.64， 1.84， 1.95， 2.19， 2.29， 1.43， 2.17， 2.08， 2.60 and 1.79 times of that in the control leaves， respectively. The co-infection of B. tabaci and TYLCCNV could induce a significant increase in the content of H2O2 in tobacco plants compared with the feeding of B. tabaci.

Keywords tomato yellow leaf curl China virus; Bemisia tabaci; tobacco; reactive oxygen species; H2O2; induction response

植物成功識別病原體侵染后會伴隨著細胞內活性氧（reactive oxygen species，ROS）的產生[1-2]。ROS在應激反應刺激下產生，通常被認為是氧化應激指示標志物，可以在植物不同的細胞器中產生，如線粒體、葉綠體和過氧化物酶體，它們是植物光合作用和呼吸作用等不同代謝和生理過程的副產物[3]。生物脅迫在加速植物系統中ROS的產生方面起著關鍵作用[4]。能夠誘導氧化損傷的ROS包括單線態氧（1O2）、超氧化物（[O-2]），過氧化氫（H2O2）、羥基自由基（OH·）、烷氧基（RO·）、過氧基（ROO·）、有機過氧化氫（ROOH）等[5]。起初，ROS被認為是應激代謝的有毒副產物，導致氧化應激損傷，是細胞死亡的“殺手”[6]。最近的研究表明，ROS作為細胞響應不同生物和非生物脅迫、發育過程和程序性細胞死亡的一類信號分子，在植物防御中發揮著關鍵作用[7]。

H2O2是最穩定的活性氧，能以分子的形式穿透細胞膜，并能從其產生位置擴散一定距離[8]。研究表明，H2O2在植物防御細菌和真菌侵染過程中起著重要作用[9]。目前，植物受到食草動物攻擊后，蟲害組織中ROS的來源尚不清楚。研究發現，在鈴夜蛾屬（Helicoverpa）昆蟲侵染大豆期間，大豆內的O2?和OH·含量增加[10]。也有研究認為，來自Helicoverpa唾液腺的葡萄糖氧化酶等酶會產生H2O2，這可能有助于提高攻擊部位的ROS濃度[11]。

煙粉虱（Bemisia tabaci）屬半翅目（Hemiptera）、粉虱科（Aleyrodidae），作為重要的農業害蟲及菜豆金黃花葉病毒屬病毒的傳播媒介，給農業生產造成了嚴重的經濟損失[12-13]。近年來，有關煙粉虱—雙生病毒—宿主植物三者互作的研究已有不少報道[14]，但目前為止，有關ROS在三者互作過程中的誘導響應情況還未被報道，有關宿主植物如何通過調控自身體內ROS來防御煙粉虱取食及其與TYLCCNV共侵染也未見報道。因此，本研究以健康煙草為材料，利用DAB染色法檢測煙粉虱取食及其與TYLCCNV共侵染不同時間后煙草葉片中H2O2的積累情況，然后采用H2O2定量分析試劑盒測定2種處理不同時間的煙草葉片內H2O2的含量變化，分析2種處理對煙草葉片內H2O2產生量的影響差異，探索煙草植株如何通過調控H2O2含量來防御煙粉虱取食及其與TYLCCNV的共侵染，進而為研究煙粉虱—TYLCCNV—宿主植物三者之間的互作機制提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試植物。健康煙草（Nicotiana tabacum NC89）種子由河南科技大學園藝與植物保護學院董鈞鋒老師提供。將種子播于育種盤中，置于光照培養箱內培養，待植株生長至2～3片真葉移栽至小盆（直徑10 cm左右），每盆1株，定期澆植物營養液，待植株生長至3～4片真葉時用于試驗。

1.1.2 供試昆蟲。MED隱種煙粉虱（GenBank 登錄號：KY100013）是2015年9月采自河南省洛陽市的芝麻寄主并一直維持在健康煙草植株上的蟲群。飼養溫度為（26±1） ℃，相對濕度為40%～60%，光照周期為L∶D=16 h∶8 h。用RAPD-PCR方法不定期檢測煙粉虱種群純度，一般2～3代檢測1次。選取羽化后2 d內的煙粉虱成蟲用于后續試驗。攜帶TYLCCNV的煙粉虱獲取方法參考Jiu等[15]，即將收集的羽化后2 d內的煙粉虱成蟲轉接于養蟲籠內被TYLCCNV侵染的煙草毒株上，在毒株葉片上取食獲毒48 h即為攜帶TYLCCNV的煙粉虱。收集獲毒48 h后的成蟲個體用于后續試驗。

1.1.3 試劑及儀器。H2O2定量試劑盒購于上海生工生物工程有限公司；3，3′-二氨基聯苯胺（DAB）染色液購于南京建成生物工程研究所；光照培養箱（PGX-330A-12H）購于寧波萊福科技有限公司；JXFSTPRP-24全自動樣品快速研磨器由上海凈信實業發展有限公司生產；SMART生物顯微鏡、CDD TP510專業彩色相機及OPTPro顯微圖像分析軟件，均為重慶奧特光學儀器有限公司生產。

1.2 方法

1.2.1 煙草植株的處理方法。選取3～4片真葉期長勢較為一致的健康煙草植株，置于養蟲籠（120目網紗，規格大小為60 cm×60 cm，塔形，帳篷式）內，分別用微蟲籠將攜帶和未攜帶TYLCCNV的煙粉虱成蟲轉接于煙草植株葉片上，每籠100頭，每株2籠，同時以夾有微蟲籠但未接蟲的煙草植株作對照。在試驗處理0.5、1、3、6、12 h和1、3、5、7、9 d時，將用于取食處理的煙粉虱成蟲個體除去并收集植株，用于DAB染色和H2O2含量測定。

1.2.2 DAB染色法檢測煙草葉片內的H2O2積累。采用組織化學方法檢測H2O2。該方法基于3，3′-二氨基聯苯胺（DAB）的氧化反應，在H2O2存在下，二氨基聯苯胺被氧化為紅棕色[16-17]。DAB染色方法參考Kempema等[18]的方法并稍做修改。收集處理不同時間的煙草植株，用蒸餾水清洗2～3次，再用吸水紙輕輕吸干植株葉片及根部水分。用2.8 mmol/L DAB（pH 3.68）染色液浸沒整個煙草植株，避光真空滲透20 min，然后在37 ℃條件下避光培養5 h。去除DAB溶液，加入95%乙醇，沸水浴10～15 min除去色素，顯微鏡下觀察DAB染色結果并成像。每個處理重復3次。

1.2.3 定量分析不同處理后煙草葉片內H2O2含量。煙草葉片內H2O2的定量分析按照H2O2定量分析試劑盒說明書進行。植株處理方法同1.2.2，迅速剪取處理的植株葉片，準確稱取0.1 g，在低溫條件下快速勻漿，4 ℃，10 000 r/min離心10 min，吸取上清液置于冰上，待測。定量分析方法參考任利娜[19]。H2O2濃度計算公式：樣品中H2O2濃度（?mol/L）=該樣品稀釋液的過氧化氫濃度×樣品稀釋倍數。每個處理3次重復。

1.3 數據分析

數據統計分析采用SPSS 18.0軟件，組間分析采用One-Way ANOVA進行兩兩比較得到相應P值，檢驗組間差異顯著性。

2 結果與分析

2.1 各處理不同時間點煙草葉片內H2O2的組織化學定位

不同處理的煙草葉片內H2O2的組織化學定位結果如圖1和圖2所示。由圖1、2可知，在不同處理的0.5、1、3、6、12 h和1、3、5、7、9 d時，無處理對照葉片（圖1A和圖2E）、煙粉虱取食處理葉片（圖1B和圖2F）、煙粉虱與TYLCCNV共侵染處理葉片（圖1C和圖2G）內均未檢測到H2O2積累。

2.2 各處理不同時間點煙草植株中H2O2的定量分析

由表1可知，在處理的0.5、1、3、6和12 h時，煙粉虱取食均可誘發煙草植株內H2O2含量較對照顯著升高，其H2O2含量分別是對照的1.62、1.71、1.77、1.77和1.95倍；煙粉虱與TYLCCNV共侵染處理的煙草植株內H2O2含量也均較對照顯著升高，其H2O2含量分別是對照的1.64、1.84、1.95、2.19和2.29倍。與煙粉虱取食處理相比較，煙粉虱與TYLCCNV共侵染處理0.5和1 h時，H2O2含量在2種處理植株間差異不顯著，而在處理3、6和12 h時，H2O2含量在2種處理植株間的差異均達顯著水平（P<0.05），煙粉虱與TYLCCNV共侵染植株中H2O2含量分別是煙粉虱取食植株的1.10、1.23和1.18倍。

從表2可以看出，除處理后第9 d以外，煙粉虱取食均可誘發煙草植株內H2O2含量較對照顯著升高，煙粉虱取食處理第1、3、5和7 d，植株內H2O2的含量分別是對照的1.46、1.82、1.63和1.53倍；煙粉虱與TYLCCNV共侵染處理均可誘發煙草植株內H2O2含量較對照顯著升高，共侵染處理的第1、3、5、7和9 d，植株內H2O2的含量分別是對照的1.43、2.17、2.08、2.60和1.79倍。與煙粉虱取食處理相比較，共侵染處理的第1 d，H2O2含量在2種處理植株間差異不顯著，而處理的第3、5、7和9 d，H2O2含量在2種處理植株間的差異均達顯著水平（P<0.05），共侵染處理植株內H2O2含量分別是煙粉虱取食植株的1.19、1.28、1.69和1.66倍。

3 討論與結論

已有研究表明，H2O2在植物防御生物脅迫過程中起著重要作用，可通過DAB染色法觀察植物組織中H2O2的積累[18， 20-23]。在本研究中，煙粉虱取食及其與TYLCCNV共侵染處理的煙草葉片內均未檢測到局部H2O2積累（圖1、圖2），甚至在整個植株中也未檢測到H2O2積累。與本研究結果相似的是，Kempema等[18]在對擬南芥經銀葉粉虱（B. tabaci type B）取食過程中的防御反應研究中發現，雖然經銀葉粉虱若蟲取食危害21 d，在取食過程中也未檢測到擬南芥植株內局部細胞死亡和H2O2積累，但作者認為不能忽視在銀葉粉虱若蟲與擬南芥相互作用過程中，H2O2會在短暫或更早的時間點產生的可能性。Giovamini等[24]的研究也發現，在經黑穗蠅（Mayetiola destructor）幼蟲取食0、2、6、12、18、24、48、72或96 h的小麥（Triticum aestivum）組織中也均未檢測到黑穗蠅取食誘導的H2O2積累。有趣的是，在馬鈴薯蚜蟲（Macrosiphum euphorbiae）取食3、6和12 h的番茄葉片內未觀察到H2O2積累，而在取食24 h的番茄小葉主脈和次脈處則檢測到H2O2積累[25]。由此可見，不同的植物被不同昆蟲取食后所誘導的H2O2積累情況有所差異。

DAB染色分析的敏感性可能有限[25]。活性氧檢測困難與其壽命短以及活細胞清除活性氧的能力有關[4]。本研究雖然在所檢測的樣品中未成功檢測到H2O2的積累，但不能排除在不同處理過程中存在微氧化爆發的可能性，以及通過植物過氧化氫酶或存在于煙粉虱唾液中的過氧化物酶有效清除H2O2的情況。因此，進一步對煙粉虱取食及其與TYLCCNV共侵染處理后煙草葉片內H2O2的含量進行了定量分析。在H2O2的定量分析中發現，2種處理均誘發植株內H2O2含量較對照顯著升高（表1，表2），植株內H2O2含量的升高可能是煙草植株應對煙粉虱取食及其與TYLCCNV共侵染的一種防御反應。該研究結果也解釋了先前報道中煙粉虱取食及其與TYLCCNV共侵染的煙草植株內一些氧化酶酶活性較對照顯著升高的一個重要原因[26]，通過氧化酶活性升高清除被侵染植株內產生的過量H2O2，進而降低ROS對植株自身造成傷害。

有關植物在病毒侵染后發生氧化爆發的現象已有詳細報道[27]。研究發現煙草花葉病毒（Tobacco mosaic virus，TMV）侵染煙草后可導致煙草葉片壞死并伴隨O2-產生[28]。西葫蘆黃化花葉病毒（Zucchini yellow mosaic virus，ZYMV）侵染西葫蘆后誘導植株內H2O2含量升高[29]。大豆黃化花葉病毒（Bean yellow mosaic virus，BYMV）侵染及水楊酸處理誘導大豆植株內H2O2含量及多種氧化酶活性升高[30]。本研究發現，煙粉虱與TYLCCNV共侵染處理較煙粉虱取食處理可誘導煙草葉片中產生更多的H2O2，這可能是共侵染處理可誘導煙草植株較煙粉虱取食植株產生更強防御反應的結果。由此可見，植物在遭受病毒及其傳播媒介共侵染的過程中可誘發更多量的ROS以防御昆蟲的取食及病毒的侵染。宿主植物煙草可通過調控自身體內H2O2的含量來防御煙粉虱取食及其與TYLCCNV共侵染。本研究為進一步研究煙粉虱—雙生病毒—宿主植物3者互作過程中ROS的作用及調控機制提供理論基礎。

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（責編：何 艷）

基金項目 國家自然科學基金（31672036）。

作者簡介 茹寧辰（1998—），男，河南濟源人，在讀碩士。研究方向：煙粉虱—雙生病毒—宿主植物三者互作機制。