根際促生細菌對甘薯苗期生長的影響及其促生機制

張玉琴　胡靜　尉繼強　葉全　劉剛　丁建國　張華德　王同勇　朱海波

關鍵詞：根際促生細菌：甘薯：幼苗生長；連作障礙：溶磷作用

中圖分類號：S531.01 文獻標識號：A 文章編號：1001-4942（2023） 03-0051-07

甘薯（Ipomoea batatas L.）是我國重要的糧食、飼料以及工業(yè)原料作物之一，也逐漸成為一種新型能源作物，其產(chǎn)量的穩(wěn)步增長對相關產(chǎn)業(yè)發(fā)展具有重大意義。然而，由于多種原因，山東丘陵地區(qū)的甘薯產(chǎn)量往往較低，其中，最重要因素為多年連作導致的土壤肥力下降、土傳病害頻發(fā)等。Ali等研究表明，不適當?shù)母髦贫葧M一步加劇土壤肥力問題，導致土壤過度沖刷、養(yǎng)分淋失以及土壤結構破壞。而向土壤中添加特定有益微生物類群，能夠有效改善寄主根際微生態(tài)環(huán)境，提高山地土壤質量，有望實現(xiàn)甘薯的優(yōu)質高產(chǎn)。

國內(nèi)外研究表明，有益微生物能夠直接調控植物生長發(fā)育過程中的激素代謝、基因表達以及功能酶活性，同時改善寄主根際的微生態(tài)環(huán)境，提高其抵抗生物與非生物脅迫的能力，有效增加作物產(chǎn)量。根據(jù)微生物存在部位以及與寄主的互作形式，微生物被分為葉圍微生物、根際微生物、內(nèi)生菌三大類。相比于內(nèi)生性微生物，根際微生物可以有效定殖于土壤生態(tài)位點，對于解決土壤帶來的栽培生產(chǎn)問題有著極佳效果。目前，有關根際有益微生物促進甘薯增產(chǎn)提質的研究較少，且相關研究一般局限于固氮細菌、溶磷細菌以及叢枝菌根真菌的作用。解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefacens）與枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中最常見的根際有益細菌，可以提高土壤酶活性，協(xié)調土壤養(yǎng)分，誘導寄主植物相關抗病促生基因（PR1 a/c、H1N1、ctd1、ERF2等）表達，在促進寄主作物生長以及病害防治方面具有廣泛應用。本研究以分離自多年連作太子參健康土壤中的解淀粉芽孢桿菌C05與枯草芽孢桿菌G03為對象，利用體外平板試驗對其促生能力進行分析評價，并以甘薯為供試作物研究這兩株根際細菌對其幼苗生長前期的促生作用，分析兩株根際細菌對土壤理化性質、土壤主要酶活性以及甘薯主要抗病促生基因的調控表現(xiàn)，以期為C05與G03在甘薯上的進一步應用提供理論依據(jù)與技術支持。

1材料與方法

1.1試驗材料

試驗于2022年在青島市中國農(nóng)業(yè)科學院煙草研究所進行。供試甘薯品種為煙薯25。供試根際微生物分離菌株解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefacens）C05與枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）G03從多年連作太子參的健康土壤中分離得到，其對植物根系具有一定親和性，田間存活率高。

1.2根際細菌分離株的體外促生指標測定

1.2.1產(chǎn)鐵載體能力測 定將解淀粉芽孢桿菌C05（下文簡稱C05）與枯草芽孢桿菌G03（下文簡稱G03）的菌液（OD₆₀₀=0.5，10μL）接種于CAS瓊脂培養(yǎng)基上，于28℃恒溫培養(yǎng)96 h。培養(yǎng)結束后，測定平板中橙色區(qū)域以及菌落直徑，計算鐵載體產(chǎn)生指數(shù)（SPI）。計算公式如下：

SPI=（橙色區(qū)域+菌落直徑）／菌落直徑。

1.2.2無機磷酸鹽溶解能力測定 將C05與G03（OD600=0.5，10μL）接種于含0.5%磷酸三鈣的Pikovskaya（PVK）瓊脂培養(yǎng)基中，于28℃培養(yǎng)7d。培養(yǎng)結束后，通過計算溶解指數(shù)（SI）來定量評價分離株溶解無機磷酸鹽能力。計算公式如下：

SI=（透明光暈+菌落直徑）／菌落直徑。

1.2.3產(chǎn)蛋白酶活性測定 將C05與G03（OD60=0.5，10μL）接種于含1%脫脂奶粉的CYE瓊脂平板上，于28℃恒溫培養(yǎng)Sd。培養(yǎng)結束后，計算產(chǎn)蛋白酶活性指數(shù)（PAI），進而定量評價兩株根際細菌產(chǎn)蛋白酶活性能力。計算公式如下：

PAI=（透明區(qū)域+菌落直徑）／菌落直徑。

1.2.4合成生長素（IAA）能力測定 將20μLC05與G03細菌懸浮液（OD600= 0.5）接種于含10mmol/L色氨酸的20 mL LB培養(yǎng)基中，并于28μ、150 r/min條件下孵育72 h。培養(yǎng)結束后，取1mL培養(yǎng)上清液（6000×g，10min）與100 mL正磷酸（10mmol/L）、2mL Salkowski試劑混合，在室溫下充分反應20 min，隨后于530 nm波長下測定吸光度，并通過標準曲線法進行絕對定量。

1.3盆栽促生試驗設計及有關指標測定

選擇甘薯作為寄主植物在溫室中進行盆栽促生試驗。栽培盆規(guī)格：底徑9.5cm，上口徑14.0cm，高11.2cm。盆中土壤取自青島市即墨區(qū)鰲山衛(wèi)鎮(zhèn)孫家白廟村田間，其基礎理化性質：有機質8.5 mg/g、總氮1.2 mg/g、硝態(tài)氮8.7μg/g、銨態(tài)氮7.9μg/g、速效磷27.0μg/g、速效鉀105.7μg/g，電導率218.6μS/cm，pH值6.5。于4月20日每盆栽種3株。

試驗設計：將C05與G03接種于LB液體培養(yǎng)基中，28℃、150 r/min條件下培養(yǎng)48 h，之后離心（5000×g，5 min），收集菌體并重新溶解于無菌蒸餾水中得細菌懸浮液。將40 mL細菌懸浮液（OD₆₀₀=0.5）于4月30日接種在甘薯幼苗（苗齡20天）根際，對照加入等量水（CK）。在整個試驗期間，保證充足水分供應，養(yǎng)護溫度為25～28℃，相對濕度為70%，光照循環(huán)為12 h。

接菌后10、20 d進行甘薯農(nóng)藝性狀（主蔓長、有效葉數(shù)、最大葉面積）調查，并收取甘薯莖葉、根系、土壤樣品，測定地上部鮮重與干重、地下部鮮重與干重、葉片葉綠素含量，土壤主要酶活性、理化性質由江蘇博研生物科技有限公司測定。每處理60株甘薯，重復3次。

1.4基因相對表達量測定

利用RNA提取試劑盒Plant Total RNA Kit（北京莊盟生物）提取葉片總RNA，借助瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA濃度與完整性，并利用反轉錄酶HiScript Ⅲ RT SuperMix（南京諾唯贊）將RNA反轉錄為cDNA，進行基因相對表達量的測定。擴增體系包括：DNA 1.0μL、SYBR qPCR Master Mix10.0μL，上、下游引物各0.4μL，無菌水補足20μL。采用2^-△△Ct法計算基因PR1 a/c、HIN1、ctd1與ERF2的相對表達量。

1.5數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用Microsoft Excel與Origin軟件處理數(shù)據(jù)和作圖，采用SPSS 20.0軟件Duncans法進行差異顯著性分析。

2結果與分析

2.1根際細菌體外促生能力分析評價

由平板試驗結果（表1）可以看出，解淀粉芽孢桿菌C05與枯草芽孢桿菌G03均具有無機磷酸鹽增溶作用，SI值分別為4.46、2.97，表明C05溶解磷酸三鈣能力顯著強于G03。兩株根際細菌都具有產(chǎn)鐵載體與蛋白酶的能力，與溶磷作用類似，C05能力更強。C05產(chǎn)IAA濃度為49.72μg/mL，顯著高于G03（22.37μg/mL）。表明相對于G03，C05具有更高的促生潛力。

2.2盆栽甘薯根際細菌的促生效果與評價

如表2所示，與CK相比，根際接種解淀粉芽孢桿菌C05與枯草芽孢桿菌G03后20 d，薯苗主蔓長、最大葉面積、地上部鮮重和干重、地下部干重和葉片葉綠素a、b含量均顯著提高，以C05的促生效果最為顯著。10 d時，接種C05與G03的薯苗地下部鮮重與CK無顯著差異，20 d時接種C05的地下部鮮重顯著高于CK，這表明C05對甘薯塊莖生長有較大促進作用，但這種作用是緩慢推進。甘薯幼苗葉片中葉綠素a、b含量存在顯著差異，表明C05與G03能夠通過改善葉片的光合作用來促進甘薯生長發(fā)育。

2.3根際細菌對土壤理化性質的影響

與CK相比，接種解淀粉芽孢桿菌C05與枯草芽孢桿菌G03后盆栽甘薯土壤的總氮、硝態(tài)氮、銨態(tài)氮、有機質、速效磷、速效鉀含量均顯著提高，而土壤電導率與pH值無顯著差異（表3）。其中，20 d時，接種C05土壤總氮（2.35mg/g）、硝態(tài)氮（23.17μg/g）、銨態(tài)氮（25.77μg/g）、有機質（25.76mg/g）、速效磷（43.97μg/g）、速效鉀（225.3μg/g）含量均最高。表明，接種C05與G03可以改善土壤主要理化性質，促進總氮、硝態(tài)氮、銨態(tài)氮等氮素釋放，利于甘薯幼苗快速生長。

2.4根際細菌對土壤酶活性的影響

由圖1A看出，根際接種兩株細菌均能顯著提高土壤脲酶活性，最優(yōu)處理為C05，10、20 d時較CK分別增加56.33%、121.77%，3個處理間差異顯著。土壤蔗糖酶可以將蔗糖水解成相應單糖而被植物體吸收，其酶促作用產(chǎn)物與土壤有機質、氮、磷含量息息相關。如圖1B所示，10 d時，接種C05與G03的土壤蔗糖酶活性均顯著高于CK，20 d時C05土壤蔗糖酶活性（604 U/g）進一步提高，且顯著高于G03（437 U/g）與CK（264U/g），與CK相比，10、20 d時接種C05與G03的土壤酸性磷酸酶活性均顯著提升（圖1C）。過氧化氫酶是土壤微生物代謝的重要酶類，在H202清除系統(tǒng)中發(fā)揮著重要作用，與土壤有機質含量、土壤肥力因子密切相關。接種C05與G03的土壤過氧化氫酶活性顯著增強，20 d時C05該酶活性為CK的2.28倍（圖1D）。表明，甘薯根際接種C05與G03后土壤脲酶、蔗糖酶、酸性磷酸酶、過氧化氫酶活性均顯著增強，可以更加快速地水解轉化土壤中的主要營養(yǎng)成分，提高土壤肥力。

2.5根際細菌對甘薯葉片主要抗病、生長基因表達的影響

如圖2所示，接種解淀粉芽孢桿菌C05與枯草芽孢桿菌G03對甘薯葉片抗病基因PR1 a/c表達量沒有顯著影響，但可以顯著激活H1N1基因的表達，有利于提高甘薯幼苗的系統(tǒng)抗性，促進其健康生長。與CK相比，接種C05、G03均顯著提高葉片促生基因ctd1、ERF2的相對表達量，其中，20 d時C05對兩個促生基因的激活達到最大值。說明，根際接種C05與G03之后，甘薯葉片中特定的抗病基因、促生基因可以被充分激活，為幼苗前期快速生長提供必要保障。

2.6土壤理化性質與土壤酶活性的相關性分析

為了確定土壤理化性質與土壤酶活性之間的內(nèi)在聯(lián)系，對兩者的主要指標進行相關性分析，結果如圖3所示。接菌后10 d時土壤總氮含量與銨態(tài)氮、速效磷、速效鉀含量呈顯著正相關（P<0.05，下同）；土壤硝態(tài)氮含量與土壤脲酶活性呈顯著正相關，這一相關性與土壤脲酶作用有關，因為土壤脲酶可以水解尿素，產(chǎn)生氨與碳酸，而土壤脲酶活性完全可以反映土壤氮素狀況；土壤有機質含量與土壤過氧化氫酶活性呈顯著正相關，表明土壤有機質含量的提高，與土壤微生物代謝密切相關（圖3A）。

如圖3B所示，接菌后20 d時土壤脲酶、蔗糖酶、酸性磷酸酶活性與pH值呈顯著正相關，表明土壤特定微生物代謝的改變，可以影響土壤主要酶活性，進而有利于酸化土壤的改良；土壤硝態(tài)氮含量與脲酶、蔗糖酶、過氧化氫酶活性，土壤氨態(tài)氮含量與過氧化氫酶活性均表現(xiàn)出顯著正相關關系。表明，土壤理化性質的變化主要由土壤酶活性轉變所引起，而土壤酶活性高低又與土壤微生物群落結構與演變密不可分。

3討論與結論

本研究通過平板試驗分析了分離自連作太子參土壤的解淀粉芽孢桿菌C05與枯草芽孢桿菌G03的體外促生能力。首先，兩株根際細菌均具有優(yōu)異的轉化無機磷酸鹽能力，這與前人研究得出的其能高效持續(xù)地為寄主提供可溶性磷元素、促進植物生長發(fā)育的結論一致。根際有益細菌另一種關鍵營養(yǎng)獲取方式主要依靠鐵載體進行，鐵載體是由微生物產(chǎn)生的鐵螯合化合物，可有效減少植物缺鐵現(xiàn)象的出現(xiàn)。除了為寄主提供螯合鐵，根際有益細菌產(chǎn)生的鐵載體在植物中還具有多重作用，比如誘導系統(tǒng)抗病性、清除和隔離病原體中的鐵進而控制病害發(fā)生。而本研究結果表明，C05與G03都可以產(chǎn)生鐵載體。生長素是一類重要的植物激素，能夠調節(jié)植物發(fā)育和生長。根際有益細菌可以產(chǎn)生一種自然形式的生長素IAA，其在細胞增殖中發(fā)揮作用，促進植物根系、莖葉的伸長。本研究發(fā)現(xiàn)兩株根際細菌菌株都能夠從色氨酸合成IAA，進而顯著促進寄主植物生長，而這一發(fā)現(xiàn)與前人研究結論一致。因此，甘薯幼苗主要農(nóng)藝性狀的改善可能得益于兩株根際細菌產(chǎn)生的IAA。除了促進宿主生長外，IAA還與植物的多種發(fā)育過程有關，比如頂端優(yōu)勢、向地性感應、繁殖等，這使得IAA成為最關鍵的植物激素之一。

盆栽試驗結果表明，甘薯幼苗根際接種C05與G03細菌后，主蔓長、最大葉面積、地上部鮮重和干重、地下部干重和葉片葉綠素a、b含量均顯著提升，從而有效促進植株前期生長，利于培育壯苗。為了驗證這兩株根際有益細菌對土壤的改良效果，測定了盆栽甘薯土壤的主要理化性質，結果顯示，C05與G03均可以促進總氮、硝態(tài)氮、銨態(tài)氮釋放，改善土壤營養(yǎng)結構，進而提高連作土壤的可耕作性。相較于CK，接種根際細菌土壤脲酶、蔗糖酶、酸性磷酸酶、過氧化氫酶活性均增強，土壤養(yǎng)分供給有所提高。本研究中，接種C05與G03甘薯葉片的抗病基因H1N1和促生基因ctd1、ERF2表達量均顯著升高，表明兩株根際細菌可以誘導植株體內(nèi)相關基因的表達，增強甘薯自身免疫，促進其健康生長發(fā)育。而相關性熱圖結果顯示，多個土壤理化指標與土壤酶活性表現(xiàn)出顯著正相關關系，這可能與土壤微生物類群的特定演變有關。

綜上看出，分離自連作太子參土壤的解淀粉芽孢桿菌C05與枯草芽孢桿菌G03具有體外促生能力，對甘薯幼苗有促生作用，可有效改善土壤營養(yǎng)構成，提高土壤主要酶的活性，誘導甘薯抗病、促生基因的表達，增強寄主系統(tǒng)抗病性。利用植物根際細菌是綠色環(huán)保的生物防治方式，加大根際有益細菌的鑒定挖掘，可為微生物菌肥的開發(fā)利用提供更優(yōu)質的種質資源。