低溫脅迫對秋石斛‘三亞陽光’成苗生理特性的影響

莫順金　何嘉琦　陸順教　張志群　尹俊梅　徐詩濤

關鍵詞：秋石斛；成苗；低溫脅迫；生理特性；耐寒性

中圖分類號：S682.31 文獻標識碼：A

秋石斛（Dendrobium spp.）別名蝴蝶石斛，是蘭科石斛屬多年生草本植物，其花色艷麗豐富，且花期較長，深受大眾喜愛。秋石斛是重要的切花材料和盆花種類，是許多國家和地區花卉產業的重要組成部分，如澳大利亞、泰國、新加坡等。據統計，我國花卉行業的市場規模在2018 年已達1562 億元，2019 年達1656 億元[1]。我國花卉市場形式逐漸改變，正在形成“西南地區的鮮切花，東南地區的苗木和盆栽，西北寒冷地區的種球，東北地區的花卉加工業”等四大生產布局[2]。在此環境下，大力發展秋石斛花卉產業對地方經濟、農民就業等有著至關重要的意義。

溫度在植物生長過程中是一個十分重要的影響因子，不同的生育期對溫度的要求都不一樣[3]。例如溫度過高或過低都會使蝴蝶蘭難以抽出花梗[4]，持續足夠的低溫條件才能讓春石斛完成花芽分化[5]，當氣溫每升高1℃時，蘭科植物的結實物候期提前2.6 d[6]，由此可見適宜的溫度對植株生長發育十分重要。秋石斛原產于熱帶及亞熱帶的一些島嶼和國家，是典型的熱帶蘭，因此對生長環境有著十分嚴格的要求，在氣溫為25～30℃，濕度為60%～70%的環境中才能正常生長和開花[7]。

其獨特的生長條件使得我國僅有少部分地區能進行生產，海南是全國唯一全部位于熱帶地區的省份，地處熱帶北緣，也是目前我國秋石斛的主要產地。但即使在海南，冬季秋石斛栽培仍會受到低溫的影響，例如在2016 年的低溫氣候就導致海南省東方市多個秋石斛品種受到低溫損傷，甚至無法正常越冬[8]。隨著全球環境氣候的變化，秋石斛更加容易遭受低溫逆境脅迫。2021 年1 月海南省多地氣溫創多年來1 月上旬新低，全島平均氣溫降幅達7～11℃，部分鄉鎮最低氣溫降至5℃以下，嚴重影響了秋石斛的冬季供花。且蘭花暴露在寒冷下，植株外部形態會明顯發生變化，葉片變黃，植株倒伏等大大影響了蘭花的觀賞性，對產業發展十分不利。我國引入秋石斛的時間較晚，對其基礎研究仍較少，目前針對秋石斛的研究主要集中在栽培管理[9-10]、花色[11-12]及組織培養[13-14]等方面。在耐寒性方面研究相對欠缺，文獻報道較少，因此，本研究以市場上廣泛栽培品種‘三亞陽光成苗為試驗材料，通過測定不同低溫條件下葉片生理指標變化規律，探索其對不同程度低溫耐受時間，以期為‘三亞陽光成苗生產中應對低溫逆境問題提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

以栽植于中國熱帶農業科學院熱帶作物品種資源研究所熱帶蘭花資源圃內的秋石斛‘三亞陽光成苗為試驗材料，挑選生長健壯，狀態良好，長勢相對一致的植株，株高約35～40 cm，苗齡為15 個月。

1.2 方法

1.2.1 試驗設計 將植株放在溫度梯度分別為15、10、5℃的人工氣候培養箱中，光暗比14 h/10 h，光強為20 000 lx，相對濕度為85%，在此環境下分別設置0（CK）、1、2、4、8 h 和 1、2、4、8、16 d 的低溫處理時間，每個處理20 株，設5 次生物學重復。處理結束后，將植株放回苗圃內恢復生長，觀察記錄落葉情況，并統計落葉率，同時觀察開花情況。

1.2.2 樣品采集 各低溫處理結束后的植株隨機采集5 株頂端的全展葉片，用超純水將葉片表明擦拭干凈，后剪碎葉片混勻，用于各項生理指標的測定。測定相對電導率的植株設置同樣的栽培環境，溫度梯度為 10、5、0、–5℃，分別低溫處理12 h，同樣隨機取5 株頂端的全展葉片用于電導率測定。每個處理重復5 次，取平均值。

1.2.3 測定方法 可溶性蛋白、游離脯氨酸、丙二醛、葉綠素及可溶性糖含量的測定方法分別參照李合生[15]的考馬斯亮藍法、磺基水楊酸比色法、硫代巴比妥酸法、95%乙醇浸提法、蒽酮比色法進行測定。

1.3 數據處理

實驗數據為5 次重復，利用Excel、SPSS、Origin 等軟件進行數據統計分析和作圖。

2 結果與分析

2.1 低溫脅迫對秋石斛成苗生理指標的影響

2.1.1 可溶性蛋白含量 可溶性蛋白是植物體內一種重要的調節物質，能在植物感受到低溫時起到一定的保護作用。由圖1A 可以看出，在不同低溫處理下，秋石斛‘三亞陽光的成苗葉片中可溶性蛋白含量呈現出一定規律，整體規律為降低–上升–降低–上升。在低溫前期處理條件下，可溶性蛋白含量的下降可能是由于秋石斛對低溫產生的應激反應，到1 h 后又全部上升。15℃和5℃處理的葉片在2 h 又下降，到1 d 時下降至最低點。而10℃處理則從1 h 上升至4 h 后又顯著下降，到2 d 時下降至最低點，然后從最低點持續上升直至最高點，而15℃和5℃處理從1 d 上升至4 d后又下降，到第8 天時才顯著上升。

2.1.2 可溶性糖含量 低溫會影響植物水分的吸收，可溶性糖是新陳代謝的主要原料，可溶性糖含量的增多能提高細胞滲透濃度，增強保水能力，是一個重要的抗寒性指標。在10℃與15℃低溫脅迫下，秋石斛‘三亞陽光成苗葉片中可溶性糖含量變化差異并不明顯（圖1B），與可溶性蛋白量變化類似，剛開始略微下降，且變化趨勢一致，后又呈現上升，下降，上升的變化規律。但是5℃處理時含量變化呈現較大差異，在處理1 h 時就上升至最高值，可能是由于5℃低溫脅迫程度較大導致可溶性糖含量大幅度增長來避免較低溫度帶來的傷害，上升至1 h 含量又顯著下降至4 h，之后又上升，到第8 小時持續下降，直至第8 天到達最低點后又迅速上升，變化幅度較大，與另外2 種溫度處理的可溶性糖含量變化不太一致。

2.1.3 游離脯氨酸含量 由圖 1C 可以看出15℃處理時，游離脯氨酸含量一直處于上升狀態，但幅度較小，5℃與10℃處理時波動上升，但增加趨勢較大，而5℃處理的游離脯氨酸含量在第8天上升至峰值后，隨著處理天數的增加，游離脯氨酸含量不升反降，有可能是此溫度太低，在這種強度溫度下，秋石斛成苗的自身保護系統受到了破壞，造成了生理損傷，導致合成的游離脯氨酸含量下降。到16 h 時3 種溫度處理的秋石斛‘三亞陽光成苗葉片游離脯氨酸含量都顯著比對照高，其中10℃時含量最高。游離脯氨酸是一種廣泛存在于植物體內的蛋白質組分，本研究中游離脯氨酸含量變化和MDA 含量變化類似，在3 種低溫處理下整體呈相近的上升趨勢，表明這2 類物質含量在低溫脅迫下敏感程度類似。

2.1.4 MDA 含量 丙二醛（MDA）是脂膜過氧化的最終分解產物，其含量可以反映植物遭受逆境傷害的程度。從圖1D 中可以看出，秋石斛‘三亞陽光成苗葉片MDA 含量在3 種低溫處理下整體呈上升趨勢，其中5℃處理時除了從第2 小時至第4 小時有小幅度下降外，整體含量增長十分明顯，表明植株在處理過程中持續受低溫傷害。15℃處理在開始持續上升，從4 h 到2 d 時間范圍內含量不斷波動，2 d 后又持續上升到達最高點，表明植株在剛開始受到低溫脅迫時受到傷害后，一段時間后出現了一定適應性，但是2 d 后MDA含量不斷增多，表明隨著處理時間越久植株受到的傷害加劇。10℃處理時開始小幅度下降，4 h時持續上升至第4 天，之后又下降至第8 天才上升至最高值。3 種溫度處理的MDA 含量均在第16 天時到達最高值，且含量相近，說明低溫脅迫隨著處理時間的延長加劇了MDA 含量的積累。

2.1.5 葉綠素含量 葉綠素是植物光合作用必不可少的一種色素，葉綠體對低溫較為敏感，低溫脅迫會對葉綠體內造成傷害，破壞葉綠素結構，使得相關合成酶活性降低導致葉綠素合成速率降低，而且分解速度加快，進而減少葉綠素積累[16]。從圖 1E 中可以看出，秋石斛‘三亞陽光成苗葉片的葉綠素含量15℃處理時先小幅度上升至1 h，之后總體呈現下降的趨勢。10℃處理時先略微下降，而后呈現上升又下降的規律，大體也呈降低趨勢，5℃處理同樣呈上升-下降-上升趨勢，直至處理1 d 時，葉綠素含量大幅度下降。第16 天時，3 種低溫處理的葉綠素含量都到達了最低值，其中15℃和10℃處理呈一定波動性，雖有下降趨勢，但下降不明顯，5℃處理的下降幅度最大，可見秋石斛對5℃冷脅迫的抵御能力較弱。

2.1.6 相對電導率及半致死溫度 隨著處理溫度的降低，秋石斛‘三亞陽光成苗葉片的相對電導率逐漸升高，在15、10、5、0℃時電導率分別為26.9%、30.8%、56.6%、72.8%，在–5℃時達到96.0%，表明葉片的細胞膜受傷害程度不斷增大，植物狀態逐漸變差。–5℃時電導率大幅度上升，接近100%，表明葉片細胞膜遭受到了嚴重傷害，此時植株已基本死亡。根據不同溫度處理下的相對電導率，擬合Logistic 方程，求得‘三亞陽光成苗的半致死溫度（LT50）為6.1℃。LT50 可代表植物在低溫環境下細胞膜系統保持穩定性和完整性的能力，所以LT50 的高低也反映了植物抗寒能力的強弱[17-18]。

2.2 低溫脅迫下對秋石斛成苗落葉的影響

葉片是植物光合作用的主要器官，生長狀況的好壞會直接影響光合效率與光合產物的積累，在植物感受到低溫脅迫時，葉片不僅生理狀況會改變，外部形態也會發生明顯的變化，秋石斛在低溫脅迫后部分葉片變黃及脫落，因此以脅迫后植株的落葉率來判斷其抗寒性是比較直觀的方法。從圖1F 可以看出15℃條件下，秋石斛‘三亞陽光成苗的落葉率變化不明顯，比較穩定，在處理第8 天時落葉率到達最高，但低于20%，從圖2 也可以明顯看出，15℃處理后的植株葉子仍然挺立。10℃和5℃條件下落葉率隨著處理時間的延長整體呈明顯上升趨勢，在處理8 h 以前，落葉率較低并且處于波動狀態，均低于20%，落葉并不多，但從8 h 后落葉率開始上升，處理2 d的落葉率開始驟升，落葉開始增多，10℃和5℃處理的落葉率都在第16 天到達最高值，16 d 時10℃處理落葉率達95.92%，葉片幾乎落光，5℃處理落葉率高達100%，葉子全部落光。表明秋石斛‘三亞陽光成苗在5℃低溫下可以耐受8 d，10℃條件下最少可以耐受16 d。從圖2～4 中也可以看出，低溫對秋石斛‘三亞陽光成苗的開花也有影響，15℃處理條件下，實驗材料的開花和花苞并沒有受到多大影響，處理后正常開花，10℃和5℃處理下，隨著處理時間延長，從處理第4 天開始，花朵明顯受到低溫脅迫影響而凋落。

2.3 低溫脅迫下秋石斛成苗葉片各生理指標及落葉率的相關性分析

通過對較低溫度（5℃ ）和較長脅迫時間（16 d）處理下的秋石斛‘三亞陽光成苗的各項生理指標進行相關性分析（表1）發現，經5℃處理后，LT50 與游離脯氨酸、MDA 含量、落葉率均有極顯著的正相關，LT50 與葉綠素含量呈顯著負相關；可溶性蛋白含量與葉綠素含量呈顯著負相關；可溶性糖含量與游離脯氨酸含量呈顯著正相關；葉綠素含量與可溶性蛋白、游離脯氨酸、MDA 含量、落葉率呈顯著或極顯著的負相關；游離脯氨酸含量和MDA 含量呈極顯著正相關，與落葉率呈極顯著負相關。

3 討論

植物抗寒性受多個方面因素的影響，其耐寒機制是一個較為復雜的過程，目前評價植物抗寒性的指標包括生理生化指標、形態指標、基因、蛋白等。在正常生長時，植株體內的各種生理指標都是穩定而協調的，當植株感受到逆境時，體內的生理指標都相應地發生變化來應對逆境[19]。目前的研究發現，與植物抗寒性密切相關的生理指標有相對電導率、可溶性糖、可溶性蛋白、丙二醛、游離脯氨酸、葉綠素含量等。

細胞膜是植物與外界環境交換信息的重要受體，在低溫逆境時細胞膜的生理變化反映了膜系統穩定性，也反映了抗性的強弱，植物受到低溫脅迫會導致膜透性改變，破壞膜的完整性，造成胞內離子外滲，引起電導率升高，丙二醛是膜脂過氧化作用相關的產物，因此相對電導率和丙二醛含量常作為耐寒指標[20-21]。本研究中，秋石斛‘三亞陽光成苗葉片的電導率隨著處理溫度降低而不斷上升，表明隨著溫度的降低，細胞膜透性不斷下降，秋石斛受脅迫更加嚴重，這個結果與許多植物的研究結果一致，如藍花楹[22]、文心蘭[23]、微型月季[24]、黃金菊[25]等。丙二醛的含量也是隨著脅迫溫度的降低和處理時間的延長呈上升趨勢，說明質膜受損加劇，與油茶[26]、茶樹[27]、豆梨[28]等結果一致。低溫脅迫下植物可以通過積累脯氨酸、可溶性糖、可溶性蛋白等滲透調節物質降低細胞滲透勢，提高植物對逆境的適應性[29]。本研究發現秋石斛‘三亞陽光成苗葉片游離脯氨酸的含量與丙二醛，電導率類似，呈上升趨勢，脯氨酸含量變化與蝴蝶蘭[30]、垂穗披堿草[31]一致。而可溶性蛋白與可溶性糖的變化比較類似，并不是單純上升趨勢，而是在處理初期先出現降低，后又上升-降低-再上升的波動，上升并不明顯，可能是這2 種物質對低溫不敏感，導致在低溫脅迫過程中合成的量很少。

植物正常的生命活動離不開光合作用，在低溫脅迫環境下為了抵御低溫，各項生命活動速率會有一定程度的降低，從而導致葉綠素含量降低[32]。隨著溫度的降低和脅迫時間的延長，秋石斛‘三亞陽光成苗葉片的葉綠素含量都呈下降趨勢，這與低溫條件處理下的柱花草[33]、蝴蝶蘭[30]、茶樹[27]葉綠素含量變化一致。

LT₅₀作為植物抗寒能力的重要生理指標之一，可以確定植物生態分布的最低溫度[34]。該方法在紅掌[35]、睡蓮[36]等熱帶植物中都被用于快速鑒定植物的抗寒性。在本研究中，根據電導率求得的‘三亞陽光成苗的半致死溫度為6.1℃，并且LT50 與游離脯氨酸、MDA 含量、落葉率均有極顯著的正相關，與葉綠素含量呈極顯著負相關，說明這些指標可以作為秋石斛‘三亞陽光成苗抗寒性評價指標。而在秋石斛‘三亞陽光中苗的研究中，可溶性糖也可以作為抗寒性評價指標，說明不僅在不同植物中抗寒關鍵指標存在差異，即使是同一種植物，不同年齡段期間指標選擇也略有不同[37]。

通過對生理和形態指標分析發現，秋石斛‘三亞陽光成苗能抵御5℃低溫持續2 d 時間，抵御10℃低溫4 d 時間，5℃低溫下超過2 d 或10℃低溫下超過4 d 可能導致‘三亞陽光成苗植株收到損傷無法恢復，這與中苗和小苗的研究結果一致[37-38]。說明‘三亞陽光并沒有因為苗期的增長導致抗寒性增加，只是評價指標略有差別。不像在喬木植物望天樹中，隨著樹齡的增長，其抗寒性不斷增強[39]。因此在實際生產中遭遇低溫災害時，不能因為秋石斛‘三亞陽光苗齡大就放松警惕降低保護，在面對不同苗齡的秋石斛低溫脅迫時，要同樣重視，保護措施需要到位。大多數植物經過低溫鍛煉能增強其抗寒能力，在了解了‘三亞陽光的耐寒溫度與時間后，可以根據此數據進行低溫鍛煉，例如10℃低溫鍛煉2 d，5℃低溫鍛煉1 d 等。前人在自然低溫條件下和模擬低溫實驗的研究中，‘三亞陽光與其他秋石斛品種比較，都屬于是抗寒性較差品種[8， 40]。但是在16 個秋石斛品種的資源評價與篩選中，‘三亞陽光被認為是最具商業開發和產業化生產的品種，綜合得分最高，表明其市場價值、經濟效益都比較好[41]。因此本研究闡述了秋石斛‘三亞陽光在低溫下的生理變化，探究‘三亞陽光不同苗齡低溫脅迫下的生理反應，對其今后生產應用，抗寒育種提供理論依據，具有一定的意義。

但現如今秋石斛耐寒品種相對較少，為選育出更多有價值的耐寒性品種，后續研究可以對市場上較受歡迎的一些品種進行低溫脅迫試驗，測定生理指標，進行耐寒能力評價。如‘水晶‘金如意，經調查是較受歡迎的品種[41]，且在自然低溫下耐寒性較強[8]，可以進一步對這些品種進行低溫脅迫試驗，探究其生理響應機制，篩選更加優質的抗寒種質資源，為今后秋石斛產業發展奠定基礎。宏觀上可以通過對植物形態以及生理生化變化的研究來鑒定植物的抗寒性；微觀上可以對植物的基因表達水平進行研究從而對植物的抗寒性進行評價。目前已經有許多與植物低溫誘導表達相關的基因已經得到分離、鑒定，也獲得了無需經過低溫馴化抗寒能力就大有提高的轉基因擬南芥植株[42]，但是秋石斛在耐寒基因方面的研究較少，今后也可以從分子方面入手，通過過表達耐寒基因培育出耐寒性較好的秋石斛品種。