姜荷花‘紅色印象’工廠化組培育苗技術研究

譚健俊　葉遠俊　劉金梅　朱根發　許偉兵　崔曉東　徐曄春

關鍵詞：姜荷花；外植體；叢生芽誘導；組培；規模化生產

中圖分類號：S682.2 文獻標識碼：A

姜荷花（Curcuma alismatifolia）為姜科姜黃屬多年生球根花卉，原產于泰國北部，主要觀賞部位是花序頂端的不育苞片，因其形似郁金香，有“熱帶郁金香”的美譽，具有花型優美、顏色艷麗、觀賞期長等優點[1-2]。荷蘭、泰國等最早對姜荷花進行開發研究和商業種植，作為優秀的切花品種引入世界花卉市場[3-4]。中國于1999 年開始引進栽培，在臺灣、廣東、福建等地均有分布種植[5]。在華南地區生長的姜荷花，自然花期在6—10 月，正好填補夏秋季節盆花和切花短缺的空檔[6]。近年來，隨著對姜荷花品種雜交選育，以及栽培技術的改良，培育了許多適合推廣的品種，如‘紅色印象‘鴻運‘影子紅等，優質種苗的需求日益增加[7-9]。自然條件下，姜荷花主要通過地下塊莖繁殖，存在周期長、效率低、病蟲害風險高等弊端，而利用植物組織培養技術，進行工廠化組培育苗，可以滿足市場對種苗的需求，實現保質保量。

目前，姜荷花組培擴繁技術研究多集中于培養基種類和激素濃度的篩選。牟小翎等[10]2006 年研究發現采用姜荷花球莖萌發的小芽作外植體，在MS+NAA 0.02 mg/L 的培養基上成功誘導叢生芽，在MS+BA 1.0 mg/L+NAA 0.02 mg/L 的培養基上進行繼代增殖，最終獲得大量組培苗并移栽成活，實現姜荷花引種國內后首次組培擴繁。商宏莉等[11]在‘紅觀音姜荷花的組織培養中發現，采用剝去被膜的球莖切成小塊后，接種到MS+BA2.0～3.0 mg/L+NAA 0.2～0.3 mg/L 的培養基上誘導叢生芽，增殖階段采用花寶2 號為主的培養基和TDZ 0.5 mg/L 的組合效果最佳，增殖系數可達3.73，經過生根壯苗后移栽成活率可達95%以上。趙彥杰等[12]研究姜荷花組培快繁技術，使用消毒后的塊莖切成帶有1～2 個芽點的小塊，接種在MS+BA 2-3 mg/L+NAA 0.2 mg/L 培養基上獲得最佳叢生芽誘導效果，增殖階段繼代接種在MS+BA2 mg/L+NAA 0.2 mg/L+10%椰子水，增殖倍數可達4.4，經過生根壯苗后移栽到疏松透氣的基質中成活率可達94%。在國外的組織培養報道中，多集中于姜黃屬姜黃、郁金等藥用植物的組培快繁，也有利用姜荷花未成熟花蕾為外植體材料誘導叢生芽的報道[13-14]。TOPPOONYANONT 等[15]使用MS+BA 10.0 mg/L+IAA 0.1 mg/L 培養基接種未成熟的花芽，利用含有高濃度6-BA 的MS 培養基誘導花芽轉變成葉芽，成功獲得大量叢生芽，在增殖繼代階段使用MS+TDZ 0.5 mg/L+IMA4.0 mg/L 的培養基，高濃度細胞分裂素使叢生芽延緩生長并不斷分化芽點，獲得大量芽簇，可使接種的1 個芽接種后增殖分枝得到30～40 個小芽簇， 最后在生根階段MS+BA 0.3 mg/L+IAA0.1 mg/L 培養基中恢復正常生長，并移栽成苗。迄今為止，對姜荷花流行品種和姜黃屬資源開展組培快繁研究較多，關于‘紅色印象的快繁研究尚未開展。

在工廠化組培擴繁育苗過程中，綜合成本和時間周期是重要的參考因素，實踐操作要求也必須降低，如外植體消毒污染率，切分叢生芽接種的操作難度等，同時小苗生長的一致性和移栽成活率也是需要注意的問題。為此，本研究以姜荷花‘紅色印象為研究對象，通過對其各個部位的外植體消毒接種，挑選作為外植體的最佳部位，增殖階段比較分析不同濃度激素對組培苗增殖系數的影響，最后生根壯苗出瓶，對移栽不同的種植基質的成活率進行比較，最終優化完善姜荷花工廠化組培擴繁育苗技術流程，實現技術與生產實踐相結合，滿足市場對姜荷花‘紅色印象種苗生產的需求。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗材料種植在廣東省農業科學院白云基地環境園藝研究所大棚內，選取外觀飽滿、干凈無損傷的姜荷花‘紅色印象種球和健壯無病蟲害的植株，分別取材姜荷花的球莖、儲藏根、球莖小芽、側芽、幼嫩花芽、幼嫩葉片進行消毒接種（圖1）。在取材前進行適當控水保持干燥，降低外植體帶菌量，其中球莖和儲藏根于休眠期取材（12 月至翌年3 月），球莖小芽于萌芽初期取材（4—5 月），側芽、幼嫩花芽、幼嫩葉片于旺盛生長期取材（6—9 月）。MS 培養基成分藥品、6-BA和NAA 購自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 不同外植體消毒處理 ①姜荷花種球球莖取回后，用洗潔精反復清洗表面，在流水下沖洗30 min，將儲藏根和球莖分離，表皮清理干凈后，在超凈工作臺上進行消毒處理，先用75%酒精消毒1 min，再加入1 滴吐溫80 的0.1%升汞溶液消毒20 min，無菌水沖洗5 遍，二者均切成小塊，球莖的小塊需帶上1～2 個芽點接種。②用沙藏法恒溫箱28℃催芽獲得姜荷花球莖小芽，待小芽萌發到2～4 cm 時切下，流水下沖洗30 min，消毒過程同上，切除消毒壞死傷口后直接接種在誘導培養基上。③選擇姜荷花主芽開花后旁邊萌發出的10 cm 以上側芽，切下后在流水下沖洗30 min，消毒過程同上，根據芽大小切分為2～4 塊帶芽點的小塊接種到叢生芽誘導培養基（圖2A）。④選取包裹在葉鞘中的未成熟花序，在超凈工作臺上剝開葉鞘切下幼嫩花序，用75%酒精消毒1 min后，無菌水沖洗5 遍，在無菌條件下剝去苞片，將其中整個花芽簇切下接種。⑤選用抽出但未展開的幼嫩葉片，用75%酒精消毒30 s 后，再加入1 滴吐溫80 的0.1%升汞溶液消毒8 min，無菌水沖洗5 遍，將幼葉切成0.5 cm×1 cm 左右的小塊，接種在誘導培養基上。

1.2.2 叢生芽誘導培養 選用 MS 培養基進行叢生芽誘導培養，設置不同的6-BA 濃度，具體配方為MS+6-BA（0、1、3、5、10 mg/L）+NAA0.2 mg/L+蔗糖30 g/L+卡拉膠7 g/L，pH 調至5.8。采用小口徑組培瓶，每瓶只接種1 個外植體（圖2B），防止交叉污染，不同部位外植體不同培養基各接種30 瓶，2 周后統計污染數量。接種后每隔1 個月繼代更換1 次培養基，并適當切除褐化組織和葉片，保留小芽，記錄下接種后第1 個月的外植體芽啟動個數。第2 個月繼代到增殖培養基上，并記錄叢生芽的小芽數量。姜荷花的幼嫩花芽誘導叢生芽的周期較長，第1 個月無明顯的芽啟動現象，因此在第2 個月時統計外植體芽啟動個數，在第3 個月繼代到增殖培養基上，并記錄叢生芽的小芽數量。按下列公式計算污染率、芽啟動率和叢生芽平均芽數：

1.2.3 叢生芽增殖培養 選用 MS 培養基進行叢生芽增殖培養，設置3 種不同6-BA 濃度，具體配方為MS+6-BA（1、3、5 mg/L）+NAA 0.1 mg/L+蔗糖30 g/L+卡拉膠7 g/L，pH 調至5.8。采用240 mL 廣口組培瓶，挑選誘導培養中健康生長的叢生芽，用無菌鑷子和手術刀將叢生芽葉子和根系去除，切割至帶有1～2 小芽的小塊，每瓶接種7 個（圖2C），每種培養基接種50 個芽塊，在培養室光照下恒溫培養，每月繼代1 次，記錄繼代接種后出芽個數，3 個月后轉入生根壯苗培養，最終統計組培苗數量，按下列公式計算增殖系數：

1.2.4 生根壯苗培養 姜荷花生根容易，只需降低激素濃度，減少叢芽誘導，使用常規的1/2 MS的生根培養基，具體配方為1/2 MS+NAA 0.1 mg/L+蔗糖20 g/L+卡拉膠7 g/L，pH 調至5.8。采用340 mL 廣口組培瓶，將增殖培養獲得的叢生芽去除葉片后，挑選優質健壯的小芽，切割成單芽接種，每瓶接種7 棵，培養室室內恒溫光照培養1個月（圖2D），剩余叢生芽可以繼代留種，作為下一輪擴繁的母瓶。

1.2.5 煉苗移栽育苗 待組培苗株高達到10 cm以上，具有3 片以上葉片時進行煉苗移栽。將達到出苗標準的組培瓶搬到大棚苗床上煉苗至少1周，清洗干凈根系附近的培養基，適當修剪葉片，用多菌靈1000 倍液溶液浸泡根系10 min，種植在50 孔育苗穴盤上，注意遮陰保濕，定植后逐漸進入正常水肥管理。基質選用純細椰糠、純細泥炭和細椰糠∶細泥炭1∶1 混合基質，每種基質各種100 棵，每組處理3 個重復，1 個月后統計移栽成活率（圖2E）。

1.2.6 組培苗遺傳穩定性檢測 采集母株和隨機選擇20 棵留種擴繁第10 代的組培苗幼嫩葉片，采用北京天根公司試劑盒提取基因組DNA，利用TP-M13-SSR 分子標記技術進行遺傳穩定性檢測。選用課題組前期開發的EST-SSR 標記用于擴增[5]，在1.5%瓊脂糖電泳中檢測擴增穩定性，并利用TP-M13 熒光測序技術進一步檢測多態性[16]。擴增產物在ABI 3730 DNA 自動測序儀上進行檢測，利用GeneMarker 1.51 對測序數據進行收集和分析。

1.3 數據處理

采用 Excel 2010 和SPSS 21.0 軟件對數據進行統計分析，并利用Duncans 法進行多重比較，檢驗各平均值在0.05 水平上的差異顯著性。

2 結果與分析

2.1 姜荷花外植體和叢生芽誘導培養基的篩選

本研究通過接種姜荷花不同部位的外植體，以不同6-BA 濃度的MS 培養基啟動誘導，研究誘導姜荷花叢生芽最高效的方法，結果如表1 和表2 所示。由表1 可知，不同的外植體污染率差別較大，其中球莖和儲藏根接種污染率較高，均達到50%以上，其他部位的接種污染率控制在20%以內，主要與外植體生長部位環境相關，初步表明地上部位消毒效果優于地下部位。在叢生芽誘導效果方面，儲藏根和葉片均無法誘導叢生芽，只有含芽點的部位可以直接誘導叢生芽。幼嫩花芽需要高濃度的6-BA 或者效果更強的細胞分裂素誘導才能產生叢生芽，且誘導培養時間最長，不適宜用于姜荷花工廠化育苗。球莖小芽和側芽的效果最好，叢生芽啟動率達70%以上，可作為外植體誘導效果最佳的材料。

由表 2 可知，當誘導培養基中6-BA 濃度上升時，叢生芽啟動率不斷增加。6-BA 濃度≥3 mg/L 時，球莖小芽和側芽的叢生芽啟動率可以達到近80%。叢生芽的平均小芽數量也隨著6-BA濃度的增加而增加，當誘導培養基中6-BA 濃度為10 mg/L，球莖、球莖小芽、側芽誘導的叢生芽平均芽數最高，達到2.4～2.5。同時發現高濃度6-BA 誘導的叢生芽雖然數量多，但小芽淺綠細長，繼代后小苗生長勢較弱，有玻璃化趨勢。幼嫩花芽的叢生芽誘導需要5 mg/L 及以上的高濃度6-BA 誘導啟動，否則無法誘導花芽轉變產生葉芽，繼而分化獲得叢生芽。結合消毒接種的操作難度，發現姜荷花誘導初代叢生芽的最佳外植體材料是球莖小芽和側芽，最佳誘導培養基為MS+6-BA （ 3 、5 mg/L ） +NAA 0.2 mg/L+ 蔗糖30 g/L+卡拉膠7 g/L，pH 調至5.8。

2.2 姜荷花叢生芽增殖培養基篩選

由表 3 可知，當增殖培養基的6-BA 濃度增加，姜荷花叢生芽的增殖系數明顯提升，其中6-BA 濃度為5 mg/L 的增殖培養基的平均增殖系數最高，達到2.54，壯苗數量也最多，為643 棵。由外植體誘導獲得的初代叢生芽，在增殖培養基上不斷繼代，每一輪的增殖系數呈現上升趨勢，外源激素在叢生芽體內累積效應明顯，其中6-BA濃度為5 mg/L 的增殖培養基在第3 輪的繼代培養中，增殖系數高達3.43。雖然在高濃度6-BA 的影響下叢生芽數量大幅增加，但叢生芽的整體質量不斷下滑，在第3 輪6-BA 濃度為5 mg/L 的增殖培養中觀察發現，部分新生的叢生芽出現伸長生長受抑制，形成被抑制的芽簇。雖然增殖系數增加，但組培苗之間生長速度變得不一致，品質也難以控制，對工廠化生產較為不利。在6-BA濃度為≤3 mg/L 的增殖培養基中未發現芽生長受抑制的現象，組培苗健壯正常生長。因此，姜荷花工廠化育苗的最佳叢生芽增殖培養基為MS+6-BA 3 mg/L+NAA 0.1 mg/L+蔗糖30 g/L+卡拉膠7 g/L，pH 調至5.8。

2.3 姜荷花生根壯苗和煉苗移栽

在增殖培養后期挑選生長健壯的單個小芽，接種在1/2 MS+NAA 0.1 mg/L+蔗糖20 g/L+卡拉膠7 g/L 的壯苗培養基上，發現組培苗生長健壯，整齊度一致，壯苗效果明顯。由表4 可知，3 種基質的移栽成活率均達到90%以上，通過方差分析顯示基質間的平均成活率無顯著差別。不同基質間姜荷花組培苗的生長情況略有差異，細泥炭保水性強，但透氣性差，出現少量組培苗根莖腐爛死亡的現象，是3 種基質中成活率最低的。細椰糠透氣性強，保水保肥能力一般，成活率接近混合基質，但小苗后期生長葉緣發黃，可能與缺素癥相關。細椰糠∶細泥炭1∶1 混合基質的平均成活率最高，達95.33%，小苗后期生長健壯，無不良癥狀，適宜作為出苗移栽的最佳基質。移栽后對小苗進行觀察，表型穩定，未發現明顯的表型變異。

2.4 組培苗遺傳穩定性分析

使用 8 對EST-SSR 標記引物對隨機選取的20株組培苗擴繁到第10 代組培苗進行遺傳穩定性分析。結果（表5）顯示，8 對引物全部可以穩定擴增出清晰的條帶（圖3），產物大小范圍為100～300 bp。毛細管電泳檢測結果如圖4 所示，引物JHH12 在母株和20 株組培苗中均有2 個峰值，產物大小完全一致，表明組培苗未發生DNA水平的變異，與母株完全一致。

3 討論

工廠化組培育苗的快速繁殖主要通過器官發生途徑實現，可分為直接器官發生途徑和間接器官發生途徑[17]。前者主要是通過主芽、側芽等作為外植體通過外源激素誘導產生不定芽，再通過人工切割操作，實現叢生芽數量的倍數增加，該途徑優點是變異率低，可以保持母本優良性狀，后者則是通過外源激素誘導外植體產生愈傷組織，通過繼代增殖愈傷組織，最終再分化得到新植株，該途徑優點是增殖系數高，外植體取材方便，只需要幼嫩葉片等作為外植體材料，但變異率高難以保持母本性狀[18]。

在本研究中，姜荷花‘紅色印象的幼嫩葉片和儲藏根接種誘導并未觀察到愈傷組織產生，可以得知姜荷花的組培快繁主要通過直接器官發生途徑，屬于較難誘導愈傷產生和再分化的植物之一，這與MAHADTANAPUK 等[19]對姜荷花組織培養研究結果相似。在外植體的選擇上，姜荷花的球莖由于長期埋在土壤中，作為外植體消毒效果差，接種后污染率高，而且由于球莖上的芽點過于幼嫩，在消毒過程中活力容易受到影響，不適宜批量取材接種。而選擇花芽作為外植體，雖然污染率低，但是取材時期受限制，只有姜荷花開花早期的5—8 月可以取材，使用花芽誘導葉芽發生需要的時間也更長，需要60～80 d。較為理想的外植體材料為球莖小芽和側芽，誘導叢生芽的時間短，只需要30～50 d。球莖小芽取材方便，可以通過沙盤法催芽全年取材。在大規模的工廠化育苗過程中，品種的準確性至關重要。所有外植體材料中，側芽的取材時期為母株第一次開花后，可以做到準確判斷品種，防止出現取材錯誤，在生產中實現保質保量。通過隨機選取20株擴繁第10 代的組培苗，提取DNA 進行的TP-M13-SSR 分子標記毛細管電泳檢測，研究結果表明8 對EST-SSR 標記引物擴增目的片段的大小數量與母株完全一致，與母株相比均未發生DNA 水平上的變異，通過該組培技術擴繁10 代的種苗依舊保持低變異率[20-21]。

姜荷花的組培以MS 培養基為主，在許多姜黃屬植物的組織培養中使用廣泛[22-24]，本研究中姜荷花組培苗生長生根健壯正常，葉片鮮綠，培養效果較好。姜荷花的增殖繼代培養主要使用6-BA、TDZ 等細胞分裂素誘導實現叢生芽的增殖，當使用低濃度細胞分裂素，如6-BA 濃度為1～3 mg/L 的MS 培養基做增殖培養時，叢生芽正常生長，增殖系數保持在2～3 之間，組培苗生長速度一致，適合作為工廠化組培快繁的增殖培養基使用。當增殖培養基中6-BA 濃度≥5 mg/L 或使用細胞分裂素活性更強的TDZ 作增殖培養時，姜荷花的部分不定芽伸長生長受到抑制，呈現被抑制的叢生芽狀態，繼代到低濃度細胞分裂素的培養基上可以逐漸恢復正常生長，其增殖系數可以達到4～8。但該增殖方式不適用于工廠化組培育苗，組培苗生長速度不一致對工廠化管理和生產計劃安排會造成較大麻煩。這種增殖方式適合優良新品種（系）的擴繁或者稀有品種的母瓶生產，高增殖系數可以快速獲得大量組培苗母瓶或者小苗。

通過本研究獲得生長整齊一致的姜荷花組培苗，同時對姜荷花組培苗的出瓶移栽育苗技術進行研究，發現姜荷花組培苗喜疏松透氣的基質，生根簡單，移栽成活率高，可達到90%以上成活率，其中組培苗種植基質選用細泥炭∶細椰糠1∶1 混合基質最佳[25]。單獨使用其中一種基質效果低于兩種混合效果，細泥炭保水性強，含有大量有機營養，但在高溫高濕條件下容易滋生病原菌，加上組培苗出瓶過程容易受到機械擦傷，種植過程中觀察到少量組培苗出現根莖腐爛現象，因此不適合直接使用細泥炭出苗種植。細椰糠整體pH呈酸性，不易滋生病菌，透氣性強，適合作為姜荷花組培苗出瓶移栽育苗的種植基質，但椰糠礦質元素含量低，栽培過程中需要及時補充營養元素，進入后期旺盛生長階段時養分供應不足，出現葉緣發黃現象[26]。椰糠適合用于混配基質，經過混合細泥炭等基質改良后使用效果更佳。

綜上，姜荷花‘紅色印象工廠化組培育苗技術的關鍵點在于克服外植體誘導叢生芽，叢生芽增殖擴繁，以及出瓶移栽育苗步驟。研究結果表明，姜荷花‘紅色印象最佳的外植體為球莖小芽和側芽，基本可以滿足全年任何時候的外植體接種需要，最佳誘導培養基為MS+6-BA（3、5 mg/L）+NAA 0.2 mg/L+蔗糖30 g/L+卡拉膠7 g/L。增殖擴繁階段的最佳叢生芽增殖培養基為MS+6-BA 3 mg/L+NAA 0.1 mg/L+蔗糖30 g/L+卡拉膠7 g/L，叢生芽增殖系數達到2～3，小芽生長健壯，切分操作簡單。生根壯苗培養基選用1/2 MS+NAA 0.1 mg/L+蔗糖20 g/L+卡拉膠7 g/L，生根率100%，經過煉苗后出瓶移栽，組培苗種植基質宜選用細泥炭∶細椰糠1∶1 混合基質最佳，出瓶移栽成活率95%以上，經過表型觀察和分子檢測，擴繁多代的組培苗表型和DNA 水平上與母株相比均未發生明顯變異。