基于Ca²⁺濃度及線粒體氧化應激探討補陽還五湯對脊髓損傷大鼠受損紅核神經元的保護作用

盧青青 范婷婷 萬彩云 張偉 謝夢洲 李亮

〔摘要〕 目的 從Ca2+濃度及線粒體氧化應激的角度探討補陽還五湯（Buyang Huanwu Decoction， BYHWD）對脊髓損傷（spinal cord injury， SCI）氣虛血瘀證紅核神經元的影響。方法 將大鼠隨機分為5組：對照組、模型組、BYHWD低劑量組（BL組）、BYHWD中劑量組（BM組）和BYHWD高劑量組（BH組）。除對照組外，其余4組均采用游泳力竭法聯合紅核脊髓束（rubrospinal tract， RST）橫斷術制備SCI氣虛血瘀證模型。BL組、BM組、BH組大鼠分別以BYHWD生藥12.825、25.650、51.300 g/kg的劑量灌胃，對照組和模型組以生理鹽水灌胃。采用斜板實驗檢測大鼠的肢體運動功能，血液流變學檢測血液的狀態，氧化應激和抗氧化能力檢測紅核超氧化物歧化酶（superoxide dismutase， SOD）活性和丙二醛（malondialdehyde， MDA）含量，原子分光光度法測定紅核Ca2+濃度，透射電子顯微鏡觀察紅核線粒體的狀態。結果 術后第1、第14、第28天，模型組斜板實驗角度均明顯低于對照組（P＜0.01）。術后第14、第28天，BL組、BM組、BH組斜板實驗角度均明顯高于模型組（P＜0.01）；BL組斜板實驗角度明顯低于BH組（P＜0.01）。與術后第1天比較，術后第14、第28天BL組、BM組、BH組斜板實驗角度均明顯升高（P＜0.01）。與對照組比較，模型組全血低切黏度、全血中切黏度、全血高切黏度、紅細胞聚集指數、卡松黏度、MDA含量和Ca2+濃度均明顯升高（P＜0.01），SOD含量明顯降低（P＜0.01）。與模型組比較，BL組、BM組、BH組全血低切黏度、全血中切黏度、全血高切黏度、紅細胞聚集指數、卡松黏度和Ca2+濃度均明顯降低（P＜0.01），BM組、BH組MDA含量均明顯降低（P＜0.05或P＜0.01），BH組SOD含量明顯升高（P＜0.05）。與BH組比較，BL組、BM組卡松黏度均明顯升高（P＜0.05）。模型組出現線粒體結構模糊、排列紊亂、染色質邊集的典型凋亡現象。BL組、BM組、BH組線粒體結構變得清晰，數目增多，染色質邊集現象改善，其中，BH組改善最為明顯。結論 BYHWD對SCI氣虛血瘀證大鼠受損紅核神經元有保護作用，促進肢體運動功能的恢復，其機制可能與BYHWD調節血液微循環，改變線粒體形態，增強線粒體抗氧化應激能力，降低Ca2+濃度有關。

〔關鍵詞〕 脊髓損傷；補陽還五湯；Ca2+；線粒體；氧化應激；紅核神經元；氣虛血瘀證

〔中圖分類號〕R274.9 ? ? ? 〔文獻標志碼〕A ? ? ? ?〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674－070X.２０23.04.004

Protective effects of Buyang Huanwu Decoction on damaged rubrospinal neurons in rats after

spinal cord injury based on Ca2+ concentration and mitochondrial oxidative stress

LU Qingqing1，2， FAN Tingting1，2， WAN Caiyun1，2， ZHANG Wei3， XIE Mengzhou1，2， LI Liang1，2*

1. Provincial Key Laboratory of TCM Diagnostics， Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China;

2. Key Laboratory of TCM Heart and Lung Syndrome Differentiation & Medicated Diet and Dietotherapy， Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China; 3. College of Integrated Chinese and Western Medicine， Hunan

University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China

〔Ａｂｓｔｒａｃｔ〕 Objective To discuss the effects of Buyang Huanwu Decoction （BYHWD） on rubrospinal neurons after spinal cord injury （SCI） of qi deficiency and blood stasis pattern from Ca2+ concentration and mitochondrial oxidative stress. Methods The rats were randomly divided into 5 groups： control， model， low-dose BYHWD （BL） group， medium-dose BYHWD （BM） group and high-dose BYHWD （BH） group. The SCI models of qi deficiency and blood stasis pattern were established in model， BL， BM and BH groups with swimming exhaustion method combined with rubrospinal tract （RST） transection， except for the control group. The BL， BM and BH groups were intragastrically perfused with crude BYHWD 12.825， 25.650， 51.300 g per kilogram of bodyweight， respectively. The control and model groups were given normal saline. The motor function of limbs was determined by inclined plate test， the blood state was tested by hemorheology， the superoxide dismutase （SOD） activity and malondialdehyde （MDA） level in nucleus ruber was measured by oxidative stress and antioxidative ability， and the Ca2+ concentration in rubrospinal neurons was determined by atomic spectrophotometry. The morphological changes of mitochondria in nucleus ruber were observed by transmission electron microscope. Results On the 1st， 14th and 28th day after operation， the angle of inclined plate in model group was significantly lower than that in control group （P<0.01）. On the 14th and the 28th day after surgery， the angle of inclined plate in BL， BM and BH groups was significantly higher than that in model group （P<0.01）. The angle of inclined plate in BL group was significantly lower than that in the BH group （P<0.01）. Compared with the 1st day after surgery， the angle of inclined plate test in BL， BM and BH group was significantly higher on the 14th and 28th day after surgery （P<0.01）. Compared with control group， the whole blood low viscosity， whole blood middle viscosity， whole blood high viscosity， red blood cell aggregation index， Casson viscosity， MDA content and Ca2+ concentration were significantly higher in the model group （P<0.01）， while the SOD content was significantly lower （P<0.01）. Compared with model group， the whole blood low tangential viscosity， whole blood tangential viscosity， whole blood high tangential viscosity， red blood cell aggregation index， Casson viscosity and Ca2+ concentration in BL group， BM group and BH group were significantly lower （P<0.01）. MDA content in BM group and BH group was significantly lower （P<0.05 or P<0.01）. SOD content in BH group was significantly higher （P<0.05）. Compared with BH group， Casson viscosity in BL group and BM group was significantly higher （P<0.05）. The model group showed typical apoptotic phenomena of fuzzy mitochondrial structure， disordered arrangement and chromatin edge set. In BL， BM and BH groups， the mitochondrial structure was clear， the number increased， and the chromatin margination phenomenon improved. Among the three groups， BH group showed the most obvious improvement. Conclusion BYHWD has protective effects on damaged rubrospinal neurons of rats after SCI with qi deficiency and blood stasis pattern， and helps recover the limb motor function. The possible mechanism is that BYHWD can regulate blood microcirculation， change the morphology of mitochondria， improve its anti-oxidative stress capability and decrease Ca2+ concentration.

〔Ｋｅｙｗｏｒｄｓ〕 spinal cord injury; Buyang Huanwu Decoction; Ca2+; mitochondria; oxidative stress; rubrospinal neurons; qi deficiency and blood stasis pattern

脊髓損傷（spinal cord injury， SCI）是常見的神經系統損傷性疾病[1]。每年約有100萬人遭受SCI，對患者、家庭和社會產生重大的心理、身體和社會經濟后果[2]。SCI常表現為截癱或四肢癱，致殘率高且治愈率低[3]。目前的治療手段可以在一定程度上緩解脊髓受壓或損傷的狀況，但對神經功能恢復的作用仍然有限。因此，如何有效降低SCI后傷殘率，緩解疼痛，促進其神經功能快速恢復仍是巨大挑戰[4]。

SCI在中醫學屬于“痿證”范疇，常伴氣虛血瘀證[5]。SCI患者多長期臥床，久臥傷氣。氣為血之帥，氣行則血行，氣傷則虛，氣虛則血行無力，從而病情經久不愈，痿軟無力[6]。本課題組前期研究發現，采用游泳力竭法聯合紅核脊髓束（rubrospinal tract， RST）橫斷手術制備SCI氣虛血瘀證大鼠模型后，補陽還五湯（Buyang Huanwu Decoction， BYHWD）可防止紅核神經元發生逆行性潰變、促進神經元的再生，改善大鼠肢體運動功能[7-10]，但是其具體機制尚不完全清楚。

中醫學認為，“氣”是維持人體生命活動的精微物質，包含生命活動所需的物質和能量等，而物質能量代謝和呼吸作用的主要場所是線粒體[11]。線粒體參與機體氧化還原反應，對保護神經元，促進神經元再生都有著至關重要的作用，細胞存活與否、狀態好壞都會隨著線粒體功能結構的變化而受到影響[12]，而線粒體功能結構的變化與Ca2+的穩態密切相關。因此，本課題組假設中醫學中的“氣虛”可能與線粒體功能下降相關，擬從紅核線粒體形態改變、Ca2+濃度變化的影響去闡釋BYHWD修復SCI的機制。

1 材料

1.1 ?實驗動物

健康雄性SD大鼠90只，8～10周齡，SPF級，體質量（200±20） g，由湖南中醫藥大學實驗動物中心提供，許可證號：SCXK（湘）2019-0004。本實驗由湖南中醫藥大學動物實驗倫理委員會批準，倫理審批號：LL2021030503。實驗動物在環境清潔、溫度為（21±2） ℃、相對濕度為30%～70%的飼養環境中分籠喂養，按時等量供給高溫高壓滅菌的飼料和水。動物飼養和實驗操作均遵循湖南中醫藥大學制定的科研動物和實驗室使用規范。

1.2 ?主要試劑、藥品

電子顯微鏡固定液（北京索萊寶科技有限公司，批號：20170727）；BCA蛋白定量試劑盒（賽默飛世爾科技有限公司，批號：23227）；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase， SOD）檢測試劑盒（批號：A001-3-2）、丙二醛（malondialdehyde， MDA）檢測試劑盒（批號：A003-1-2）均購自南京建成生物工程研究所有限公司；鈣標準貯備液（國家有色金屬及電子材料分析測試中心，批號：20A034-5）；苯巴比妥鈉注射液（天津金耀藥業有限公司，批號：1906061，0.1 g/mL）；阿莫西林膠囊（海南先聲藥業有限公司，批號：02-190503）。

1.3 ?主要儀器

強迫游泳桶（型號：Smart 3.0）、手術顯微鏡（型號：77002）均購自深圳市瑞沃德生命科技有限公司；血液流變儀（北京賽科希德科技股份有限公司，型號：SA-6600）；透射電子顯微鏡（北京捷歐路科貿有限公司，型號：JEM1230）；原子吸收光譜儀（賽默飛世爾科技有限公司，型號：ICE3000）。

2 實驗方法

2.1 ?實驗藥物制備

BYHWD處方：黃芪120 g，當歸尾6 g，赤芍4.5 g，川芎3 g，地龍3 g，桃仁3 g，紅花3 g。以上中藥飲片均購于湖南三湘中藥飲片有限公司，請湖南中醫藥大學藥學院專家鑒定，符合《中華人民共和國藥典》[13]要求。在湖南中醫藥大學中醫診斷學湖南省重點實驗室，將每種藥物飲片用電子天平進行精確稱量，每份BYHWD處方均加自身重量的10倍量水浸泡30 min，用武火煮至藥液沸騰后改為文火保持30 min，再用無菌紗布過濾藥液，將所得藥液用濾紙過濾得濾液備用。繼續向第1次煎煮過藥液的藥渣加入8倍量水，進行相同步驟得第2次濾液。將兩次濾液合并一同放入旋轉蒸發儀濃縮，濃縮至濃度為生藥2 g/g的膏劑，待冷卻后放入滅菌玻璃罐中，在4 ℃冰箱保存備用。后續使用時用蒸餾水稀釋成濃度為生藥2 g/mL的藥液。

2.2 ?動物模型制備

采用游泳力竭法聯合RST橫斷術[14]進行SCI氣虛血瘀證大鼠模型制備。水溫22～25 ℃，將大鼠分組依次進行游泳，直到出現身體無法支撐、搖晃欲倒等，表明游泳導致力竭。連續游泳21 d，建立氣虛狀態模型。在21 d的強迫游泳運動結束后，注射苯巴比妥鈉（30 mg/kg）麻醉大鼠，將大鼠固定于鼠臺，在手術顯微鏡下逐層分離大鼠頸背部肌肉組織，暴露第3、第4頸椎之間的脊髓，用手術刀的尖端迅速橫斷右側RST，建立局部“血瘀”狀態，逐層縫合，涂阿莫西林以預防感染。大鼠蘇醒后，可見右側前肢呈屈曲無力狀，且右前爪無法自由伸展，表明SCI氣虛血瘀證大鼠模型制備成功[14]。術后注意護理清潔大鼠，保持干爽，每日更換墊料。

2.3 ?動物分組與干預

將90只大鼠隨機分為對照組、模型組、BYHWD低劑量組（BL組）、BYHWD中劑量組（BM組）、BYHWD高劑量組（BH組），每組18只。除對照組外，其余4組均進行游泳力竭法聯合RST橫斷術制備SCI氣虛血瘀證模型。BL組、BM組、BH組大鼠分別以BYHWD生藥12.825、25.650、51.300 g/kg的劑量（按照體表面積藥物劑量換算公式[15]計算，分別相當于70 kg成人劑量的1、2、4倍）進行灌胃干預，對照組和模型組以生理鹽水灌胃，均1次/d，持續干預28 d后進行取材。

2.4 ?動物樣本采集與制備

每組先隨機選取6只大鼠進行取血，將大鼠稱量麻醉后，打開大鼠的腹腔，使用一次性采血針刺入腹主動脈采集5 mL血液，在4 h內完成血液流變學檢測。采完血后的大鼠，用止血鉗緩慢地將大鼠顱骨撥開，暴露大腦組織，定位中腦紅核組織所在區域，紅核位于腦橋上丘的腹側，用鑷子將紅核組織完整地分離，將紅核組織樣本放置在潔凈的EP管中并立即投入液氮中，轉存至-80 ℃冰箱。每組再隨機選取6只大鼠，以上同方式取紅核組織轉存至

-80 ℃冰箱。這12個紅核組織樣本中，6個樣本用于后續的線粒體氧化應激相關檢測，其余6個樣本用于Ca2+濃度檢測。

每組其余6只大鼠以上述方式取完整中腦放入含電子顯微鏡固定液的EP管中，暫時置于4 ℃冰箱內保存，用于后續切片染色進行電子顯微鏡檢測。

2.5 ?指標檢測

2.5.1 ?宏觀表征觀察 ?術后第28天，在自然光線下觀察每組大鼠精神狀態、爪甲黏膜和舌色，并記錄。

2.5.2 ?行為學檢測 ?每組隨機抽取6只大鼠，在RST橫斷術前和術后第1、第14、第28天進行斜板實驗。將大鼠身體軸線與斜板縱軸垂直放置，檢測大鼠能夠停留的最大角度。從水平開始增加斜板角度，每次升高5°，檢測能夠持續停留5 s而不下滑的最大角度，每只實驗大鼠測量3次，取其平均值為其運動功能值[16]。

2.5.3 ?血液流變學檢測 ?使用血液流變儀進行檢測，測定全血高切黏度、全血中切黏度、全血低切黏度、紅細胞聚集指數和卡松黏度，了解血液流變學情況。

2.5.4 ?氧化應激水平和抗氧化能力的檢測 ?從-80 ℃冰箱中取出新鮮紅核組織樣本等待其恢復至室溫，10%的樣品溶液，4000 r/min、半徑11 cm在高速離心機中持續離心10 min，取出離心管，取上清液備用。用BCA試劑盒測定蛋白濃度，且嚴格按照SOD、MDA測定試劑盒說明，配制反應體系，制備測試管、對照管、測定管。放置在37 ℃水浴箱中水浴40 min，然后分別加入顯色劑400 μL，混勻，室溫放置10 min。將可見光分光光度計分別調至550 nm和532 nm處，測定各管吸光度值，按照試劑盒說明所提供公式計算紅核組織樣本SOD活力、MDA含量。

2.5.5 ?原子分光光度法測定Ca2+濃度 ?將紅核組織樣品放置在50 mL坩堝內，加入硝酸8 mL、高氯酸2 mL，浸泡放置一夜，蓋上坩堝蓋，在電熱板上加熱60 min，打開蓋子，繼續加熱至紅棕色蒸氣揮發干凈，冷卻再加蒸餾水轉入離心管中，稀釋至50 mL，混勻。制備鈣標準貯備液，取鈣標準貯備液，用2%硝酸溶液不同Ca2+濃度下溶液的吸光度，繪制標準曲線。根據標準曲線的制備方法測定待測樣品中Ca2+的濃度。

2.5.6 ?紅核區透射電子顯微鏡觀察 ?將電子顯微鏡固定液中的中腦組織用0.1 mol磷酸漂洗液漂洗3次，每次15 min。紅核組織浸泡于1%鋨酸溶液中，4 ℃固定2 h。雙蒸水沖洗3次，每次15 min。依次浸泡于50%、70%、90%乙醇中各15 min；100%無水乙醇和環氧丙烷各浸泡3次，每次15 min，進行梯度脫水。在環氧丙烷和包埋液中進行包埋滲透。純包埋劑包埋紅核組織后置于包埋模板內，電熱恒溫干燥箱內進行聚合。超薄切片機切片，片厚70 nm，定位選取紅核組織區域，用醋酸雙氧鈾-檸檬酸鉛雙染色，使用透射電子顯微鏡觀察記錄并拍片。

2.6 ?統計學分析處理

實驗數據采用SPSS 26.0軟件進行統計分析，采用GraphPad Prism 7.0 軟件進行繪圖。數據以“ｘ±s”表示，滿足正態性和方差齊性后，多組間比較采用單因素方差分析，不滿足正態性采用Kruskal-Wallis法，不符合方差齊性則采用Dunnett's T3法。以P＜0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 ?宏觀表征觀察結果

對照組精神狀態良好、活潑好動，爪甲淡紅、毛發有光澤，舌質淡紅柔軟；模型組大鼠精神萎靡、不愛活動，且爪甲呈深紅或紫紅狀，舌質深紅，毛發黯淡。與模型組比較，BL組、BM組、BH組出現氣虛血瘀癥狀的程度較輕，部分大鼠爪甲呈深紅狀，部分無爪甲改變，可自由活動，且BH組氣虛血瘀癥狀程度最輕。在游泳聯合手術造模以及給藥干預過程中均無大鼠死亡。

3.2 ?各組大鼠行為學檢測結果

術前各組間斜板實驗角度比較，差異均無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。術后第1、第14、第28天，模型組斜板實驗角度均明顯低于對照組（P＜0.01）。術后第14、第28天，BL組、BM組、BH組斜板實驗角度均明顯高于模型組（P＜0.01）；BL組斜板實驗角度明顯低于BH組（P＜0.01）。與術后第1天比較，術后第14、第28天BL組、BM組、BH組斜板實驗角度均明顯升高（P＜0.01）。模型組斜板實驗角度術后第14、第28天與術后第1天比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。詳見表1。

3.3 ?血液流變學檢測結果

與對照組比較，模型組全血低切黏度、全血中切黏度、全血高切黏度、紅細胞聚集指數和卡松黏度均明顯升高（P＜0.01）。與模型組比較，BL組、BM組、BH組全血低切黏度、全血中切黏度、全血高切黏度、紅細胞聚集指數和卡松黏度均明顯降低（P＜0.01）。與BH組比較，BL組、BM組卡松黏度均明顯升高（P＜0.05）。詳見表2。

3.4 ?紅核氧化應激和抗氧化檢測結果

與對照組比較，模型組MDA含量明顯升高（P＜0.01），SOD含量明顯降低（P＜0.01）。與模型組比較，BM組、BH組MDA含量均明顯降低（P＜0.05或P＜0.01），BH組SOD含量明顯升高（P＜0.05）。BL組與模型組間MDA含量比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。BL組、BM組與模型組間SOD含量比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。詳見表3。

3.5 ?紅核Ca2+濃度檢測結果

與對照組比較，模型組Ca2+濃度明顯升高（P＜0.01）。與模型組比較，BL組、BM組、BH組Ca2+濃度明顯降低（P＜0.01）。詳見表4。

3.6 ?紅核透射電子顯微鏡觀察結果

對照組紅核組織中線粒體為橢圓形或卵圓形，線粒體結構清晰完整，線粒體嵴排列有序緊密，核膜完整且細胞核呈飽滿圓形；模型組紅核組織中線粒體結構模糊呈腫脹空泡狀，線粒體嵴碎裂溶解狀，伴有髓樣化改變且數目減少，核膜內陷變形且有明顯的染色質凝結邊集現象，為典型的凋亡現象；BL組紅核組織中線粒體空泡現象減少，腫脹減輕，可以看到卵圓形線粒體結構和少量線粒體嵴排列，核膜變形減輕且染色質邊集程度減輕；BM組線粒體結構和線粒體嵴更加清晰，染色質邊集現象明顯好轉；BH組改善最為明顯，有橢圓形和卵圓形線粒體，結構清晰，嵴的數量增多，核膜附近基本無染色質邊集。詳見圖1。

4 討論

根據中醫理論“勞則氣耗”理論，本課題組選擇游泳力竭法模擬建立“氣虛”狀態。在中樞神經系統中，紅核通過RST將小腦和大腦皮質等處的沖動傳遞到脊髓前角神經元，在調節體態和維持運動協調上具有重要作用[17]。為保證造模方式簡便有效，選擇橫斷第3、第4頸椎之間的脊髓右側RST進行造模，此方式損傷范圍小，部位較為精確，易于術后護理，可達到模擬SCI后運動功能受損明顯又不威脅生命安全的良好效果。除此以外，氣為血之帥，血為氣之母，橫斷處的局部血瘀亦可導致氣運不利。因此，游泳力竭法聯合RST橫斷術的造模方式都可以較好模擬SCI氣虛血瘀證。

斜板實驗結果可知，術前各組斜板實驗角度無差異，說明實驗大鼠術前運動功能水平相同。而模型制備術后第1天，模型組、BL組、BM組和BH組的斜板實驗角度均大幅下降，說明造模大鼠的運動功能明顯受損，造模成功。術后第14、第28天，與模型組比較，BL組、BM組和BH組的斜板角度均明顯上升，且在第2天，BH組的斜板實驗角度大于BL組，其運動功能恢復接近對照組水平，說明BYHWD對SCI大鼠的運動功能有明顯的改善作用，且BH組的療效優于BL組，提示療效可能與治療時間成正比。宏觀表征觀察結果顯示，模型組氣虛血瘀癥狀最為明顯，大多表現為爪甲深紅或紫紅、精神萎靡，BL組、BM組大鼠爪甲顏色轉淡，但精神狀態一般，而BH組大鼠爪甲血呈粉色，精神狀態良好，說明BYHWD可改善SCI大鼠氣虛血瘀癥狀且BH組效果最好，與斜板實驗結果相符，故BYHWD可以改善SCI氣虛血瘀證的表現，體現其益氣養血的功效。

SCI后血管內皮細胞損傷和組織水腫形成了缺血缺氧的微環境，不利于神經元的存活，故改善SCI后微循環障礙有助于脊髓修復[18]。血液流變學檢測血液中的細胞變形性和血漿流動性，這些指標可反映血液循環的狀態。本研究采用血液流變學檢測評價BYHWD對SCI后血液微循環的影響，結果顯示，與對照組比較，模型組不同切變率下的全血黏度、紅細胞聚集指數和卡松黏度明顯升高（P<0.01），而這些指標的值越高，說明全血的流動性越差，更易發生高黏滯血癥，而BYHWD治療組各指標值均明顯下降，說明BYHWD可減輕血液微循環障礙，緩解血瘀狀態，且BH組的卡松黏度明顯低于BL組和BM組（P<0.05），說明BH組的血液微循環改善效果優于BL組與BM組，提示一定劑量范圍內，血液微循環的改善可能與BYHWD的劑量具有正相關性。

上述血液流變學檢測結果表明，SCI后易導致血液微循環障礙，增加缺血缺氧的發生概率，而神經系統具有高耗氧量、高代謝的特點[19]，神經元在缺血缺氧狀態下會產生和釋放大量氧自由基，這些產物可破壞細胞膜，造成細胞損傷從而影響神經細胞的功能[20-22]，且神經系統在處于缺血缺氧的微環境時，易發生氧化應激反應，氧化終產物為MDA。MDA可影響線粒體呼吸鏈復合物及相關酶活性，加劇細胞膜和細胞器的損傷，是反映自由基對細胞損害程度的重要標志[23]。自由基損傷作用最早的靶點為線粒體，SOD為氧自由基清除劑，代表機體清除自由基的能力[24]，故MDA含量與SOD活力可反映組織線粒體氧化應激與抗氧化能力的變化。因此，維持線粒體氧化應激-抗氧化軸的動態平衡對抑制細胞的氧化損傷有著重要意義。紅核MDA與SOD檢測結果顯示，與對照組比較，模型組的MDA含量上升（P<0.01），SOD含量下降（P<0.01），提示SCI后出現明顯的氧化應激反應，紅核抗氧化能力減弱，細胞過氧化損傷程度較重；與模型組比較，BM組、BH組的MDA含量下降（P<0.01），BH組的SOD含量上升（P<0.05），說明BYHWD可改善紅核線粒體氧化應激水平，增抗氧化能力，降低自由基對細胞過氧化的損傷程度，且BH組效果最好。

細胞線粒體氧化磷酸化受阻，將會導致ATP合成受阻，從而使細胞膜上依賴ATP的鈣泵功能受損，繼而影響Ca2+穩態[25]。本研究中Ca2+濃度檢測結果顯示，與對照組比較，模型組的Ca2+濃度明顯上升（P<0.01），說明SCI后，線粒體形態發生改變，影響氧化應激反應可引起Ca2+濃度上升。Ca2+濃度上升一方面可加速自由基的生成，加重對線粒體的損傷，另一方面還可影響膜的流動性，使線粒體膜形態發生改變，形成惡性循環，加重SCI癥狀。而與模型組比較，BL組、BM組與BH組的Ca2+濃度均下降（P<0.01），說明BYHWD可以抑制Ca2+濃度上升，維持Ca2+平衡，防止形成惡性循環來保護線粒體。本研究中透射電子顯微鏡結果也驗證了這一點，電子顯微鏡下對照組紅核神經元超微結構非常清晰，胞核形態飽滿，核膜清晰，線粒體嵴排列整齊均勻，結構清晰，數量較多；而模型組的紅核神經元胞核出現凝集現象，線粒體嵴腫脹且排列散亂，伴空泡化，數量明顯減少，染色質邊集明顯，說明Ca2+濃度增加后，線粒體膜結構明顯受到影響。與模型組比較，BL組、BM組與BH組電子顯微鏡下紅核神經元的超微結構也發生了改變，胞核凝集現象減輕，核膜變形減輕，線粒體形態逐漸恢復，且BH組恢復情況最好，說明BYHWD可以保護線粒體的形態結構，且BH組優于BL組、BM組。

綜上所述，通過游泳力竭法聯合RST橫斷術制備大鼠氣虛血瘀證模型后應用BYHWD進行治療，實驗結果驗證了BYHWD對SCI氣虛血瘀證大鼠的神經細胞有保護作用，有利于SCI氣虛血瘀證大鼠運動功能的恢復，其機制可能與BYHWD調節血液微循環、增強線粒體抗氧化能力、降低Ca2+濃度有關，提示我們可以從保護紅核神經元、改善線粒體抗氧化能力和調節Ca2+濃度等方面尋求更為有效的SCI治療策略。然而，關于BYHWD調節線粒體氧化應激的蛋白通道和Ca2+的具體分子機制，有待進一步研究，以便更加完善地闡述其作用機制。

參考文獻

[1] LIU X Y， ZHANG Y W， WANG Y T， et al. Inflammatory response to spinal cord injury and its treatment[J]. World Neurosurgery， 2021， 155： 19-31.

[2] WILES M D. Airway management in patients with suspected or confirmed traumatic spinal cord injury： A narrative review of current evidence[J]. Anaesthesia， 2022， 77（10）： 1120-1128.

[3] 田 ?婷，李曉光.脊髓損傷再生修復中的問題與挑戰[J].中國組織工程研究，2021，25（19）：3039-3048.

[4] CHEN X K， WANG Y Y， ZHOU G， et al. The combination of nanoscaffolds and stem cell transplantation： Paving a promising road for spinal cord injury regeneration[J]. Biomedecine and Pharmacotherapie， 2021， 143： 112233.

[5] 宋漢秋.補陽還五湯治療急性缺血性腦梗塞46例[J].陜西中醫，2013，34（2）：158-160.

[6] 趙繼榮，蔡 ?毅，陳 ?文，等.中藥治療脊髓損傷相關機制研究進展[J].中華中醫藥學刊，2021，39（8）：5-9.

[7] 周 ?彬，范瑜潔，聶 ?穎，等.補陽還五湯聯合BMSCs移植對脊髓損傷氣虛血瘀證紅核神經元的影響[J].湖南中醫藥大學學報，2019，39（5）：568-572.

[8] 聶 ?穎，范瑜潔，王梟冶，等.補陽還五湯聯合骨髓間充質干細胞移植對脊髓損傷氣虛血瘀證的療效[J].神經損傷與功能重建，2021，16（12）：714-718.

[9] YANG P， CHEN A， QIN Y， et al. Buyang Huanwu Decoction combined with BMSCs transplantation promotes recovery after spinal cord injury by rescuing axotomized red nucleus neurons[J]. Journal of Ethnopharmacology， 2019， 228： 123-131.

[10] NIE Y， FAN Y J， ZHANG X， et al. Buyang Huanwu Decoction improves neural recovery after spinal cord injury in rats through the mTOR signaling pathway and autophagy[J]. The Journal of Spinal Cord Medicine， 2023， 46（1）： 99-106.

[11] 林 ?飛，郭麗麗，王 ?階.基于線粒體的功能闡釋中醫“氣”的作用[J].中國中西醫結合雜志，2014，34（8）：903-906.

[12] 范婷婷，萬彩云，盧青青，等.補陽還五湯改善脊髓損傷的抗氧化功能及作用機制[J].世界中醫藥，2021，16（12）：1818-1823.

[13] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典[M].北京：中國醫藥科技出版社，2020：42，127，139，165，315.

[14] LI L， LI F， YIN J， et al. Establishment and evaluation of a rat model of spinal cord injury with the pathopattern of qi-deficiency and blood-stasis in traditional Chinese medicine[J]. Digital Chinese Medicine， 2018， 1（1）： 102-112.

[15] 陳 ?安，張建偉，伍校瓊，等.補陽還五湯對紅核脊髓束橫斷后神經元的保護作用[J].中國臨床解剖學雜志，2007（6）：665-668.

[16] 陳 ?萌，馬 ?泉，鄭小影，等.大鼠脊髓橫斷模型的建立及米諾環素對膠質纖維酸性蛋白表達的影響[J].解剖學雜志，2014，37（3）：352-355.

[17] MARTINEZ-LOPEZ J E， MORENO-BRAVO J A， MADRIGAL M P， et al. Red nucleus and rubrospinal tract disorganization in the absence of Pou4f1[J]. Frontiers in Neuroanatomy， 2015， 9： 8.

[18] FIGLEY S A， KHOSRAVI R， LEGASTO J M， et al. Characterization of vascular disruption and blood-spinal cord barrier permeability following traumatic spinal cord injury[J]. Journal of Neurotrauma， 2014， 31（6）： 541-552.

[19] 譚榮鎊，魏 ?波，李廣盛. Nrf2-ARE調控神經-血管交互作用參與脊髓損傷后的神經修復[J].中國組織工程研究，2021，25（35）：5694-5701.

[20] 郭志強，劉云峰，王 ?佳，等.安宮牛黃丸聯合亞低溫對心臟驟停心肺復蘇后患者腦氧代謝率及氧化應激損傷的影響[J].湖北中醫藥大學學報，2022，24（5）：20-23.

[21] 肖玉煥，韓 ?麗，李浩然，等.靈芝多糖防治中樞神經系統疾病的研究進展[J].中草藥，2020，51（24）：6391-6395.

[22] 孫忠人，徐思禹，李 ?全，等.近5年中藥治療脊髓損傷相關機制研究進展[J].中國中醫藥信息雜志，2019，26（11）：132-135.

[23] 汪湛東，毛忠南，張 ?娜，等.基于氧化應激損傷和炎癥反應探討中風康復膏對腦缺血再灌注損傷模型大鼠的保護作用[J].中國民族民間醫藥，2022，31（16）：15-19，52.

[24] BUOSI P， BORGHI F A， LOPES A M， et al. Oxidative stress biomarkers in treatment-responsive and treatment-resistant schi？鄄zophrenia patients[J]. Trends in Psychiatry and Psychotherapy， 2021， 43（4）： 278-285.

[25] 金曉雪，焦 ?凱，劉德敏.線粒體功能障礙與血管平滑肌細胞鈣化[J].中華高血壓雜志，2022，30（7）：633-637.

〔收稿日期〕2022-11-07

〔基金項目〕湖南省自然科學基金項目（2022JJ30435，2018JJ2289）。

〔第一作者〕盧青青，女，碩士研究生，研究方向：中醫藥修復中樞神經系統損傷。

〔通信作者〕*李 ?亮，男，博士，副教授，碩士研究生導師，E-mail：superliliang@126.com。