基于SPME-GC-MS和電子鼻技術對牛肉蛋白肽美拉德反應產物風味成分分析

桂海佳 任麗蓉 王曉華 李澤林 谷大海 王雪峰 肖智超 王桂瑛 范江平

摘要：擬探究不同肽段的牛肉蛋白肽美拉德反應產物的風味特性。以牛肉邊角料為原料，經酶解后采用液相串聯質譜（liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）對其酶解液中肽分子量及分布進行分析；再以不同肽段的牛肉蛋白肽為基料進行美拉德反應，利用電子鼻技術（electronic nose，E-nose）、氨基酸自動分析儀、頂空固相微萃取法-氣相色譜-質譜聯用（headspace solid-phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry，HS-SPME-GC-MS），結合偏最小二乘法判別分析，分析不同肽段的牛肉蛋白肽美拉德反應產物（BPM）的揮發性風味物質。結果表明，在未分肽段的牛肉蛋白肽美拉德反應液（BPMS）中共鑒定出68種揮發性成分；牛肉蛋白肽美拉德反應液最佳肽段為1～3 kDa （BPM 1～3），BPM 1～3的肽段經過美拉德反應后亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸和精氨酸含量明顯增加，從BPM 1～3中共鑒定出50種揮發性成分，包括醇類、酮類、酯類、雜環類、烷類、醛類等；BPMS與BPM 1～3共有14種揮發性化合物差異較明顯。

關鍵詞：牛肉蛋白肽；美拉德反應；HS-SPME-GC-MS；電子鼻；偏最小二乘法判別分析

中圖分類號：TS201.21? ? ? 文獻標志碼：A? ? ?文章編號：1000-9973（2023）05-0160-07

Abstract： The purpose of this study is to investigate the flavor characteristics of Maillard reaction products of beef protein peptides with different peptide segments. With beef offals as the raw materials， the molecular weight and distribution of peptides in the hydrolysate are analyzed by liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry （LC-MS/MS） after enzymatic hydrolysis; and then different beef protein peptides are used as the basic materials for Maillard reaction. The volatile flavor substances of different beef protein peptide Maillard reaction products （BPM） are analyzed by electronic nose （E-nose）， automatic amino acid analyzer， headspace solid-phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry （HS-SPME-GC-MS） and partial least squares discriminant analysis. The results show that 68 volatile components are identified in the unsegmented beef protein peptide Maillard reaction solution （BPMS）.The optimal peptide segment of beef protein peptide Maillard reaction solution is 1～3 kDa （BPM 1～3）， and the content of leucine， tyrosine， phenylalanine? and arginine

收稿日期：2022-11-11

基金項目：云南省專家工作站（202005AF150016）；校企合作項目（KX142021018）

作者簡介：桂海佳（1996-），女，碩士，研究方向：食品加工與安全。

*通信作者：范江平（1972-），男，教授，博士，研究方向：食品科學。

in the peptide segment of BPM 1～3 increases significantly. Fifty volatile components are identified in BPM 1～3， including alcohols， ketones， esters， heterocycles， alkanes， aldehydes and so on. There are 14 significantly different volatile compounds in BPMS and BPM 1～3.

Key words： beef protein peptide; Maillard reaction; HS-SPME-GC-MS; electronic nose; partial least squares discriminant analysis

牛肉作為我國第二大肉類消費品，其肉質鮮美，富含蛋白質、礦物質、B族維生素等多種營養成分[1]，還具有低脂肪、低膽固醇等優點[2—5]。在牛肉加工以及零售過程中會產生大量的邊角料，這些邊角料和牛肉營養差別較小，但是在市場上利用率低，其利用的方式較單一，包括工業油、重組牛肉制品、肥料及燃料等，未將牛肉邊角料的營養價值充分利用，造成資源浪費、環境污染、碳排放超標等問題。牛肉邊角料中的蛋白肽可以作為呈味肽的良好來源，將其運用到調味品中，將有利于提高牛肉加工的附加值，獲得良好的經濟效益。

目前獲得牛肉蛋白肽的處理方法主要包括酶解法、化學法及微生物發酵法等，其中酶解法是最環保、安全、高效的方法。酶解可以將蛋白質水解成多肽、游離氨基酸，更有利于人體消化吸收，降解后的活性多肽具有降低膽固醇、降血脂、抗氧化等多種生物活性[6—10]。美拉德反應主要指羰基化合物（醛類、酮類以及還原糖類）和氨基化合物（氨基酸、多肽和蛋白質等含氮化合物）之間的反應[11—12]。它能夠為食品提供誘人的色澤和愉快的香氣，使食物的香氣醇厚飽滿，減少食物本身的腥味，在食品風味形成和改善過程中起到重要作用，被廣泛運用于天然肉類香精香料的生產中[13—14]。目前，對美拉德反應的研究主要集中于對游離氨基酸-美拉德反應體系或肽-美拉德反應體系，其中揮發性風味化合物、非揮發性呈味及呈色化合物都是美拉德反應研究的熱點問題[15]。

結合牛肉邊角料的綜合利用情況，本研究以牛肉邊角料作為原料，采用酶解及超濾手段得到不同肽段的牛肉酶解液，對其進行美拉德反應后，采用氨基酸分析、頂空固相微萃取-氣相色譜-質譜聯用技術和電子鼻技術對美拉德反應液進行風味成分及聚類熱圖分析，結合偏最小二乘判別分析（partial least squares discriminant analysis，PLS-DA），研究不同肽段美拉德反應液樣品間風味組分差異，探究牛肉不同肽段的風味特性，可以豐富調味品種類，為實現標準化生產提供很好的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮牛肉（西門塔爾牛）邊角料，剔除油脂較厚以及筋、腱較多的部分：昆明蒜村菜市場。葡萄糖（分析純）：天津市風船化學試劑科技有限公司；木糖（食品級）：上海源葉生物科技有限公司；葡萄糖（食品級）：國藥集團化學試劑有限公司；硫胺素（食品級）：上海曙光生物化學制品廠；L-半胱氨酸鹽酸（食品級）：Biosharp 生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

SPME儀器：7890B-5977B氣相色譜-質譜聯用儀（GC-MS） 美國安捷倫公司；CTC三位一體自動進樣器、PEN3電子鼻 德國Airsense公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 牛肉酶解工藝流程

牛肉邊角料預處理→加水混勻→加入木瓜蛋白酶→水浴酶解→滅酶→加入風味蛋白酶→水浴酶解→滅酶→離心→取上清液備用。

酶解條件：木瓜蛋白酶：牛肉與水的比例為1∶1、酶解溫度53 ℃、pH 7.0、酶解時間310 min、酶添加量3.5%；風味蛋白酶：牛肉與水的比例為1∶1、酶解溫度51 ℃、pH 7.5、酶解時間210 min、酶添加量2.5%。

1.3.2 不同肽段分離純化流程

酶解工藝優化后的牛肉酶解液經過離心后，將離心上清液過濾膜抽濾，得到澄清的蛋白質酶解液，一方面將澄清的蛋白酶解液經過美拉德反應，得到牛肉蛋白肽美拉德反應液（BPMS），另一方面將澄清的蛋白酶解液通過1，3，5 kDa濾膜超濾處理后，得到不同肽段的蛋白質酶解液，進行美拉德反應后得到不同肽段的美拉德產物<1 kDa（BPM 1），1～3 kDa（BPM 1～3），3～5 kDa（BPM 3～5），>5 kDa（BPM 5）。

1.3.3 美拉德反應工藝流程及褐變程度

在澄清的蛋白酶解液中加入5.0%等量的還原糖和木糖、1.4%半胱氨酸鹽、溫度118 ℃、時間54 min。利用紫外分光光度計測定經美拉德反應后的反應物在294，420 nm處的吸光度值，利用吸光值確定其褐變程度。

1.3.4 LC-MS/MS分子量分布測定

采用液相串聯質譜（liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）對蛋白酶解液多肽含量以及分子量分布進行分析。

液相串聯質譜分析：反相柱信息：C18柱；色譜儀器：EASY-nLC 1200；質譜儀器：Q_Exactive HF-X；色譜分離時間：90 min；A：2%乙腈+0.1%甲酸；B：80%乙腈+0.1%甲酸；流速：300 nL/min；梯度：MS掃描范圍（m/z）：200～2 000。

1.3.5 電子鼻分析

試驗流程：預熱儀器30 min，啟動自動清洗傳感器120 s，檢測樣品流速為300 mL/min，信號采集60 s進行測定。

準確吸取20 mL美拉德反應液置于容量瓶中，密封靜置20 min，當瓶中的氣體達到平衡后進行檢測。

1.3.6 游離氨基酸的測定

根據GB 5009.124—2016《食品安全國家標準 食品中氨基酸的測定》的方法，采用氨基酸自動分析儀進行測定。

1.3.7 HS-SPME-GC-MS揮發性成分測定

采用頂空固相微萃取法分析BPMS和BPM 1～3的揮發性成分差異。樣品處理方法及SPME-GC-MS條件參數參考桂海佳等[16]的測定方法及參數。

SPME條件：溫度50 ℃；振蕩速度和時間分別為250 r/min、15 min，萃取30 min；解吸及GC循環時間分別為5，50 min。

GC條件：進樣和接口溫度260 ℃；流量1 mL/min；柱溫40 ℃，保持5 min，以5 ℃/min升至220 ℃，以20 ℃/min升至250 ℃，保持2.5 min。

MS條件：離子源及四級桿溫度分別為230 ℃，150 ℃；質量范圍20～400 amu；電離方式EI+，電子能量70 eV；NIST 2014譜庫。

1.4 數據處理

每組試驗重復3次，采用Origin 8.0進行試驗數據處理；采用Design-Expert 8.0統計分析軟件進行試驗設計和結果分析；采用IBM SPSS Statistics 21.0進行試驗數據差異顯著性分析；采用電子鼻WinMuster軟件進行相應PCA和LDA分析；試驗數據以“平均值±標準差”表示。

2 結果與分析

2.1 牛肉酶解液中多肽的分布

牛肉原料經酶解后的酶解液總離子流圖見圖1，牛肉蛋白酶解液通過液相串聯質譜后不同肽段的相對分子量見圖2。

由圖2可知，>4 kDa的肽段所占含量較少，1～3 kDa的肽段含量較多。

2.2 不同牛肉蛋白肽美拉德反應產物的褐變

由圖3可知，在294 nm條件下，4組肽段的吸光度值總體較高，BPM<1和BPM 1～3兩組肽段產生的美拉德產物比BPM 3～5和BPM>5組略多；在420 nm條件下，BPM<1肽段組的吸光度值最高，BPM 1～3組次之。從吸光度方面分析來看，BPM<1、BPM 1～3肽段組美拉德反應較好。

2.3 不同肽段的牛肉蛋白肽美拉德反應電子鼻檢測結果

2.3.1 傳感器區分貢獻率分析

電子鼻Loadings分析是傳感器對樣品中揮發性物質進行區分的一種研究方法，主要考察樣品中哪類氣體物質起主要區分作用，并判別其貢獻率大小。不同肽段的牛肉蛋白肽美拉德反應Loadings分析見圖4。

傳感器W1W（對硫化物敏感）距x=0最遠，說明W1W對第一主成分貢獻率最大、響應值最高，說明產生了較多硫化物，含硫化合物被認為是形成肉香的重要化合物，能夠為美拉德反應產物提供基礎肉香，因此可以確定硫化物賦予牛肉蛋白肽美拉德反應液肉香；傳感器W1S（對甲基類敏感）距y=0最遠，說明W1S對第二主成分貢獻率最大，其次為W2S（對醇類敏感）和W3C（對芳香成分敏感）；除W1W（對硫化物敏感）外，W2S、W1S及W5S（對氮氧化合物敏感）對第一主成分也有較大貢獻率；綜合以上結果，美拉德反應后香氣物質的變化可能主要與硫化物、醇類、芳香類及氮氧類等揮發性物質有關。

2.3.2 主成分分析結果

不同肽段的牛肉蛋白肽美拉德反應產物距離越遠說明二者之間的氣味差異性越大。由圖5可知，兩個主成分累計貢獻率為99.3%，遠大于80%，說明該模型能夠很好地反映原始數據。4個不同肽段美拉德反應產物數據點均沒有重疊，表明不同肽段的牛肉蛋白肽在經過美拉德反應后會產生不同的風味。

結合蛋白肽的含量和美拉德褐變程度，采用BPM 1～3肽段組美拉德反應物和未分段的牛肉蛋白肽美拉德反應液（BPMS）對比呈味特性，開展差異研究。

2.3.3 BPMS、BPM 1～3游離氨基酸含量對比分析

由表1可知，BPM 1～3的肽段經過美拉德反應后，亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸和精氨酸含量明顯增加。與此同時，本身具有鮮味特征或者為鮮味肽的組成氨基酸的谷氨酸、組氨酸、丙氨酸等均有不同程度的增加，說明經過超濾分離出BPM 1～3的牛肉蛋白肽在美拉德反應后增強其鮮味特征。對比必需氨基酸的含量，除纈氨酸外，其余必需氨基酸含量都有不同程度的增加，說明篩選肽段的方式對提高牛肉蛋白肽呈味特性和營養價值具有可行性。

2.4 BPM 1～3與BPMS的比較

2.4.1 揮發性成分的比較

采用頂空固相微萃取結合GC-MS分析反應產物的揮發性成分組成，見表2。

從BPMS中共鑒定出68種揮發性成分，包括醇類12種、酮類4種、酸類2種、酯類3種、烯類2種、酚類1種、雜環類13種、烷類11種、醛類7種、醚類2種、其他類11種。從BPM 1～3中共鑒定出50種揮發性成分，包括醇類8種、酮類3種、酸類1種、酯類3種、雜環類11種、烷類6種、醛類7種、醚類4種、其他類7種。二者美拉德反應產物的主要揮發性成分包括醇類、酮類、雜環類、醛類、烷類；其中經過肽段篩選后，發現醇類含量總體升高（如乙醇、糠（基）硫醇、甲硫醇等），醛類、烷類、雜環類含量總體降低（如苯乙醛、異戊醛、三氯甲烷、2，4-二甲基己烷、嘧啶、噠嗪等）。而乙醇、糠（基）硫醇、丙酮醇、蘑菇醇、芳樟醇等呈現蘑菇香味或者其他香味的醇類，具有水果香氣的乙酸乙酯，有肉類香氣的吡嗪類雜環物質，烷類物質大多香氣較弱或無味，但烴類化合物可能作為雜環類化合物的重要中間體對風味形成具有基底作用。烯烴類化合物可作為醛類、酮類的前體物質對風味形成具有潛在作用。說明經過肽段篩選后，香味物質更加濃郁。

2.4.2 偏最小二乘法判別分析

采用SIM CA-P 11.5對兩組樣品香氣組分進行偏最小二乘判別分析，以揮發性組分的相對含量為自變量，建立PLS-DA模型。由圖6可知，BPMS與BPM 1～3可明顯區分，證明兩組樣品各有差別并且模型穩定性較好。

2.4.3 差異代謝物聚類及其顯著性差異代謝物分析

醛類物質的主要來源是脂肪的降解和氧化，醛類物質可以賦予肉類特殊的脂肪香味，盡管醛類化合物相對含量較低，但其閾值也較其他風味物質低，因此它是肉類中主要的風味貢獻物質[17]。雜環類物質大都具有很強的肉香味以及極低的香氣閾值，主要有呋喃、吡咯、吡嗪和噻唑，如2-乙酰基噻唑具有牛肉香氣，大多數呋喃類化合物呈現似焦糖味、肉香味、焦香味、水果香味以及堅果味，具有增香的作用[18]。而噻唑類化合物是烤肉和炸肉類風味的重要組分，閾值很低，具有堅果香[19]。醇類化合物中不飽和醇閾值較低，對產品風味貢獻較高，飽和醇則對肉品風味影響不顯著，但總體而言，醇類化合物在肉制品風味中無較大貢獻，一般是由脂肪氧化分解以及醛酮類化合物還原所得[20—23]。

兩組揮發性風味組分間存在差異，選擇同時具有多維統計分析變量權重值（VIP>1）且單變量統計分析（P<0.05）的化合物，對具有顯著性差異的化合物進行聚類熱圖分析（見圖7），發現BPMS與BPM 1～3的香氣主要在乙醇、糠（基）硫醇、丙酮醇、蘑菇醇、芳樟醇、乙酸乙酯、4-甲基-5-羥乙基噻唑、2，5-二甲基吡嗪、2-甲基吡嗪、噻喃、十甲基環五硅氧烷、三氯甲烷、異戊醛、苯乙腈14種化合物中差異較明顯，其中乙醇、糠（基）硫醇、噻喃3種化合物在BPM 1～3中含量更高，呋喃、吡嗪類等其余11種化合物與BPM相比都有一定程度的降低。

3 結論

電子鼻能夠較好地區分不同肽段的牛肉蛋白肽美拉德反應產物，且不同肽段的牛肉蛋白肽美拉德反應產物的香氣差異較大。通過篩選肽段，分離出1～3 kDa的牛肉蛋白肽在美拉德反應后，除纈氨酸外，其余必需氨基酸含量都有不同程度的增加，說明篩選肽段的方式可能具有提高牛肉蛋白肽的呈味特性和營養價值的作用。

對比揮發性風味成分發現，1～3 kDa肽段的美拉德反應產物（BPM 1～3）與未分肽段的牛肉蛋白肽美拉德反應液（BPMS）的揮發性風味成分差異較大，從BPMS中共鑒定出68種揮發性成分；從BPM 1～3中共鑒定出50種揮發性成分；對比二者的揮發性成分，共14種揮發性化合物差異較明顯，說明肽段篩選的方式能有效改變牛肉蛋白肽揮發性成分組成。

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