16S rDNA鑒定泡椒鳳爪中的腐敗菌

孫玉俠 黃國保

摘 要：泡椒鳳爪是我國西南泡椒肉系列工業化產品中的代表性產品。本文采用傳統分離培養結合16S rDNA分子生物學方法，鑒定引起泡椒鳳爪脹袋變質的微生物。結果顯示，引起腐敗的主要是葡萄球菌、芽孢桿菌、假單胞菌。本文根據特定腐敗菌的生物學特性，提出了相關建議，以期延長泡椒鳳爪的貨架期。

關鍵詞：泡椒鳳爪；16S rDNA；腐敗菌；鑒定

Special Spoilage Organism of Chicken Feet with Pickle Pepper by 16S rDNA

SUN Yuxia1， HUANG Guobao2

（1.Chengdu Agricultural College， Chengdu 611100， China;

2.Guangxi Key Lab of Agricultural Resources Chemistry and Biotechnology， Yulin 537000， China）

Abstract： Chicken Feet with Pickled Pepper is a representative product of the series of industrialized products of pickled pepper meat in Southwest China. In this paper， the traditional isolation and culture combined with 16S rDNA molecular biology method was used to identify the microorganisms that cause the bag swelling and deterioration of pickled pepper chicken feet. The results showed that Staphylococcus， Bacillus and Pseudomonas were the main causes of corruption. According to the biological characteristics of specific spoilage bacteria， this paper puts forward relevant suggestions to prolong the shelf life of pickled pepper chicken feet.

Keywords： Chicken Feet with Pickle Pepper; 16S rDNA; spoilage organism; identication

雞爪富含膠原蛋白，營養價值較高，20世紀70年代以前主要作為禽肉制品烹飪的下腳料，1978年后，我國開始進口西方國家肥厚、型大、價廉的雞爪，西南地區勞動人民以其食物的新鮮麻辣特色為出發點，創造性地將雞爪與泡椒結合到一起，制作出具有鮮辣脆嫩風味的泡椒鳳爪。

16S rDNA分子生物學方法主要通過對微生物染色體上菌種之間差異性特異序列之間的比對鑒別微生物種屬，靈敏度高，是鑒定微生物常用的分子生物學方法。本文選取脹袋變質樣品與合格樣品進行對照，分離培養純化兩組樣品中的微生物，根據傳統細菌菌體菌落形態，并結合16S rDNA法鑒定泡椒鳳爪腐敗微生物，分析引起脹袋的特定腐敗菌，從而為加工過程中微生物污染的靶向精準控制提供科學依據，延長產品貨架期。

1 材料與方法

1.1 培養基與試劑

泡椒鳳爪樣品由重慶市計量質量檢測研究院提供。

平板計數瓊脂培養基、營養瓊脂、EMB瓊脂培養基、MRS瓊脂培養基、CN選擇性瓊脂培養基、MYP瓊脂培養基、Barid-Parker瓊脂培養基，北京陸橋技術責任有限公司。

細菌基因組提取試劑盒，天根（北京）生化科技有限公司；Mix Ex Taq 寶生物工程（大連）有限公司；PCR引物的合成以及DNA序列的測定由上海生工生物工程技術服務有限公司完成；其余試劑為分析純。

1.2 實驗方法

1.2.1 腐敗菌的分離純化

在無菌操作條件下，分別從合格樣品和變質樣品中選取雞爪、泡椒和汁液共25 g，用無菌剪刀剪碎雞爪，加入225 mL無菌生理鹽水，振蕩1 min，然后取1 mL上清液進行梯度稀釋，選擇10-1、10-2、10-3 3個稀釋度，涂布于不同的選擇性培養基上，合格樣品記為A，變質樣品記為B，培養條件見表1。每個樣品做3個平行實驗。從不同選擇性培養基的平板上，挑取各種典型生長的菌落，隨后在其各自培養基上劃線分離2～3次，得到純化的單個菌落。

1.2.2 觀察菌落特征和菌體形態

菌落特征：觀察菌落表面呈現出的形狀（褶皺、崎嶇、平滑）、菌落表面形態（干燥、濕潤）、菌落大小、邊緣形狀（缺刻狀、光滑、波狀、樹枝狀）、菌落顏色。

菌體形態：觀察芽孢位置（中間、極端）、芽孢是否膨大、芽孢形狀（桿狀、橢圓、球狀）。

1.2.3 DNA的提取與純化

挑取各純化單菌落于營養肉湯中搖床過夜培養，吸取細菌培養液2 mL，參照細菌基因組DNA提取試劑盒要求操作。

1.2.4 16SrDNA的PCR擴增

選用細菌通用引物5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'；5'-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3'[1]。先用20 μL體系進行PCR預實驗，反應條件為95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，設置52 ℃、53 ℃、54 ℃、55 ℃、56 ℃、57 ℃[2]梯度變性30 s，72 ℃延伸1 min 30 s，共30個循環；最后72 ℃延伸7 min。

擴增產物經2%瓊脂糖凝膠電泳、凝膠成像檢測，觀察目標條帶大小，并確定合適PCR反應條件，最后選取50 μL體系，即Mix Ex Taq（25 μL）、上游引物（1.25 μL）、下游引物（1.25 μL）、模板（1.25 μL）、重蒸水（21.25 μL）進行PCR反應，割膠回收并純化，送上海生工生物工程技術服務有限公司測序。對照實驗，DNA模版替換為重蒸水。

2 結果與分析

2.1 泡椒鳳爪腐敗菌的菌落特征和菌體形態

經革蘭氏染色鏡檢觀察各種菌體的形態結構，并結合各腐敗菌在瓊脂固體培養基上的菌落特征進行判斷，結果見表2。表2中A為合格樣品，B為變質樣品，A1～A4為合格樣品分離檢出的菌株；B1～B10為變質樣品分離檢出的菌株。

如表2所示，有4種微生物在兩種樣品中均有檢出，根據微生物形態分析可知，兩種樣品均有乳酸菌生長，因為泡椒鳳爪的pH值偏酸性，pH值為4.5～5.0，且泡椒鳳爪中的泡椒為乳酸菌發酵，乳酸菌是正常的有益菌，可抑制腐敗菌的生長[3]。B組樣品為脹袋變質泡椒鳳爪，初步判斷引起腐敗的為葡萄球菌、假單胞菌、芽孢桿菌，至于樣品在腐敗變質的過程中微生物區系的變化和優勢腐敗菌的腐敗機制還不清楚，有待進一步研究。

2.2 DNA提取、PCR擴增及測序

預實驗證實退火溫度設置為56 ℃較適宜，PCR擴增16S rDNA基因片段的凝膠成像圖，測序結果也表明，PCR實驗所獲得的擴增產物為實驗目的菌株16S rDNA基因片段。測序結果見表3。

PCR測序結果與細菌形態學表現基本一致，其中A1、B1魏斯氏菌屬，是兼性厭氧菌或微需氧菌，常見于泡菜中，也是國外香腸制品的發酵菌之一[4-5]，在正常泡椒鳳爪和腐敗樣品中均存在，可能是泡椒的發酵菌。

Staphylococcus pasteuri和Staphylococcus cohnii、Staphylococcus sp.都屬于葡萄球菌科，Staphylococcus pasteuri兼性厭氧，產酸不產氣，無法引起泡椒鳳爪漲袋變質；Staphylococcus cohnii被醫學研究中心證明抗藥性較高，在我國廣西及湖北部分鴨養殖場有發現，但其無毒力因子基因檢出，目前還未有雞養殖場報道，但雞鴨有一些相似的生活特性，因此推測其可能來源于雞養殖場；健康禽類的皮膚、羽毛、腸道等都有Staphylococcus sp.存在，它是家禽孵化、飼養、加工環境中的常見微生物。

Bacillus subillis常見于飼料中，可改善雞腸道菌群，促進吸收；Bacillus amyloliquefaciens在肉雞中可用來改善腸道免疫功能，具有抗氧化的作用；Bacillus licheniformis可降解重金屬，有效提高肉雞的生長性能、免疫力和抗氧化能力。Bacillus amyloliquefaciens和Bacillus licheniformis可能都是來源于雞飼料殘留。

Pseudomonas sp.在自然界分布廣泛，主要分布在潮濕環境中。泡椒鳳爪產品有鳳爪、泡椒、泡椒液，適宜Pseudomonas sp.生長。Pseudomonas aeruginosa是一種條件致病菌，在4℃不生長，可采用4 ℃冷藏泡椒鳳爪，來抑制其生長繁殖；Pseudomonas alcaliqenes，適宜溫度35 ℃，可能來源于水源污染。

變質樣品比合格樣品多出的微生物可能是導致泡椒鳳爪變質的腐敗菌，但由于未接種合格樣品且未進行腐敗機制研究，先不排除，結合上文及表3來看，引起泡椒鳳爪腐敗變質可能是Staphylococcus cohnii、Bacillus amyloliquefaciens、Pseudomonas alcaliqenes、Pseudomonas aeruginosa。建議加強雞爪采購源頭治理，加強加工過程管理，采用4 ℃冷鏈儲藏銷售，減少微生物污染。

3 結論

本實驗通過傳統細菌形態學和16SrDNA檢測泡椒鳳爪中腐敗菌10種，引起泡椒鳳爪變質可能有Staphylococcus cohnii、Bacillus amyloliquefaciens、Pseudomonas alcaliqenes、Pseudomonas aeruginosa。腐敗菌變變質機制、變質途徑等有待進一步研究分析。

參考文獻

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基金項目：成都農業科技職業學院青年基金項目（20QN07）；廣西農產資源化學與生物技術重點實驗室開放基金項目（2021KF10）。

作者簡介：孫玉俠（1986—），女，安徽淮南人，碩士，工程師。研究方向：農產品加工與質量檢測。