冠心病患者血清環狀RNA人腎結核蛋白4、微小RNA-665表達與冠狀動脈狹窄程度及主要不良心血管事件相關性研究

劉光姣, 王曉光, 王 焱, 王 雪, 申衛東

1.解放軍總醫院京中醫療區旃壇寺門診部,北京 100034;2.解放軍總醫院 耳鼻喉科,北京 100039

冠心病(coronary artery disease,CAD)患者病死率位居心血管疾病首位,且隨著年齡增長而增加,近年來有逐年增加的趨勢。準確評估患者病情對于改善CAD患者預后具有重要意義[1-2]。非編碼RNA,如微小RNA(microRNA,miRNA)、環狀RNA(circular RNA,circRNA)等,可參與調控血管新生、動脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)、血管內皮細胞增殖與凋亡等,在心血管疾病的病理機制中發揮重要作用[3]。微小RNA-655(microRNA-665,miR-665)參與腫瘤細胞的增殖、凋亡,還參與調節血管平滑肌細胞衰老[4-5]。有研究報道,在心肌梗死后心力衰竭大鼠心肌組織中,miR-665表達下調,上調miR-665表達可通過調節瞬時受體電位通道M7表達改善大鼠心肌纖維化[6]。生物信息學分析(http://bioinfo.life.hust.edu.cn/lncRNASNP#!/)顯示,miR-665與環狀RNA人腎結核蛋白4(circular RNA human nephronophthisis 4,circNPHP4)有靶向結合位點,推測circNPHP4可能與CAD有關。而Gensini積分可有效評估患者冠狀動脈狹窄程度。本研究旨在探討CAD患者circNPHP4、miR-665表達與冠狀動脈狹窄程度及主要不良心血管事件(major adverse cardiovascular events,MACE)的相關性。現報道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取自2020年8月至2022年5月于解放軍總醫院確診為CAD的95例患者為研究對象,并將其納入CAD組。納入標準:(1)符合CAD診斷標準[7],且經冠狀動脈造影檢查確診;(2)首次發病。排除標準:(1)合并心肌病等其他心血管疾病;(2)既往慢性心力衰竭、心肌梗死、先天性心臟病;(3)冠狀動脈移植術等治療史;(4)合并肝腎功能不全、精神疾病;(5)合并惡性腫瘤。根據Gensini評分[8],將患者分為輕度病變組(n=39)、中度病變組(n=35)、重度病變組(n=21)。另選擇同期于本院行冠狀動脈造影檢查未見明顯病變者90例納入對照組。本研究經本院倫理委員會批準(批準文號:2022013)。所有研究對象均簽署知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 治療方法 患者口服阿司匹林腸溶片治療,首次劑量300 mg/d,病情穩定后,調整劑量為100～200 mg/d維持治療。

1.2.2 血清circNPHP4、miR-665水平檢測 采用RT-qPCR檢測血清circNPHP4、miR-665相對表達量。于患者入院24 h內及對照組體檢當日,采集空腹靜脈血5 ml,3 000 r/min離心(離心半徑10 cm),離心20 min后,收集血清,于-20℃保存。總RNA提取試劑(R1030,北京普利萊)提取血清總RNA,cDNA第一鏈合成試劑盒(KGA1315,江蘇凱基)合成cDNA后,進行RT-qPCR擴增,引物購自金斯瑞生物科技有限公司,其中circNPHP4上游引物序列(5′-3′):GGACACATAGTGGAGAAAAG,下游引物序列(5′-3′):GGACACATAGTGGAGAAAAG;miR-665上游引物序列(5′-3′):ACCAGGAGGCTGAGGC,下游引物序列(5′-3′):GAACATGTCTGCGTATCTC;分別以GAPDH、U6為內參,采用2-△△Ct法計算circNPHP4、miR-665相對表達量。

1.2.3 隨訪 對所有患者進行隨訪,時間為6個月,記錄患者MACE發生情況,包括復發性心絞痛、心肌梗死、心搏驟停、嚴重心律失常等。

2 結果

2.1 對照組與CAD組一般資料比較 對照組與CAD組年齡、男性比例、體質量指數、吸煙史比例、高血壓比例、糖尿病比例、甘油三酯、總膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇比較,差異無統計學意義(P>0.05)。CAD組高密度脂蛋白膽固醇水平低于對照組,差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 對照組與CAD組一般資料比較/例(百分率/%)

2.2 對照組與CAD組血清circNPHP4、miR-665表達水平比較 CAD組患者血清circNPHP4表達水平高于對照組,miR-665表達水平低于對照組,差異均有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 對照組與CAD組血清circNPHP4、miR-665表達水平比較

2.3 不同冠狀動脈病變程度患者血清circNPHP4、miR-665水平及Gensini評分比較 輕度組、中度組、重度組患者血清circNPHP4水平、血清miR-665水平、Gensini評分比較,差異均有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 不同冠狀動脈狹窄程度患者血清circNPHP4、miR-665水平及Gensini評分比較

2.4 相關性分結果 CAD患者circNPHP4與miR-665呈負相關(r=-0.509,P<0.05),circNPHP4與Gensini評分呈正相關(r=0.528,P<0.05),miR-665與Gensini評分呈負相關(r=-0.648,P<0.05)。見圖1。

圖1 相關性分結果(a.circNPHP4與miR-665相關性;b.circNPHP4與Gensini評分相關性;c.miR-665與Gensini評分相關性)

2.5 Logistic回歸分析 患者術后MACE發生率為22.11%(21/95)。多因素Logistic回歸分析結果顯示,circNPHP4、Gensini評分是CAD患者發生MACE的危險因素(P<0.05),miR-665是CAD患者發生MACE的保護因素(P<0.05)。見表4。

表4 Logistic回歸分析

3 討論

circRNA在心血管疾病的病理過程中發揮重要作用。有研究報道,circRNA與心肌梗死、心力衰竭、心肌炎、心臟發育等密切相關,其參與CAD的病理過程,如調節心肌細胞凋亡、細胞自噬、細胞周期與衰老、血管生成及免疫調節等多個過程[9-10]。外周血中circRNA表達常作為心血管疾病病情與預后評估的標志物,如circRNA-000864在急性ST段抬高型心肌梗死(ST-segment elevation myocardial infarction,STEMI)患者中表達水平升高,是STEMI患者經皮冠狀動脈介入術后發生MACE的影響因素[11]。本研究結果顯示,CAD組患者血清circNPHP4表達水平顯著升高,提示circNPHP4可能與CAD的發生有關。目前,有關circNPHP4的研究報道較少。circNPHP4為circRNA之一,在人表皮角化細胞和包皮成纖維細胞中可被檢測。有研究報道,CAD患者血漿中circNPHP4表達顯著上調,與Syntax評分呈正相關,對CAD具有良好的風險預測能力,其機制可能與circNPHP4調節冠狀動脈內皮細胞粘附作用有關[12]。

miRNA可參與調節炎癥反應、氧化應激、細胞自噬等過程,與CAD、AS、急性心肌梗死等心血管疾病發生有關[13]。miR-665可參與調控心肌纖維化、心肌細胞炎癥反應與凋亡、腫瘤細胞遷移與侵襲等,其異常表達與多種疾病的發生相關[14-15]。有研究報道,miR-665在CAD中表達下調,上調miR-665表達可靶向調節轉化生長因子β受體1表達,抑制血管平滑肌細胞增殖[16]。在氧-葡萄糖剝奪/復氧(OGD/R)誘導的人腦微血管內皮細胞模型中,過表達miR-665可通過抑制生長抑制因子5表達,促進OGD/R誘導的人腦微血管內皮細胞增殖并抑制凋亡[17]。本研究結果顯示,CAD組患者血清miR-665表達水平低于對照組,提示miR-665水平變化與CAD發生有關;隨著冠狀動脈病變程度的升高,CAD患者血清circNPHP4表達水平逐漸升高,miR-665表達水平逐漸降低,提示CAD患者血清circNPHP4、miR-665水平變化與冠狀動脈狹窄程度有關;相關性分析結果顯示,CAD患者血清circNPHP4、miR-665表達水平呈負相關,提示circNPHP4可能靶向負調控miR-665表達參與CAD的進展。AS的形成與血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cell,VSMCs)增殖、凋亡有關。circRNA可通過海綿吸收miRNA表達,參與調節VSMCs增殖。Wang等[18]研究報道,circARHGAP32通過調節miR-665/成纖維細胞生長因子2軸,促進氧化低密度脂蛋白誘導的VSMCs增殖和遷移。由此推測,circNPHP4可能通過調節miR-665表達,調節VSMCs增殖,促進AS形成,導致CAD發生。

Gensini積分可用于評估冠狀動脈病變的嚴重程度,CAD患者Gensini評分顯著升高[19]。本研究結果顯示,CAD患者血清circNPHP4表達水平與Gensini評分呈正相關,miR-665表達水平與Gensini評分呈負相關,提示circNPHP4水平越高、miR-665水平越低,冠狀動脈狹窄程度越嚴重,檢測circNPHP4、miR-665水平對判斷冠狀動脈病變程度具有一定的參考價值;Logistic回歸分析顯示,circNPHP4是影響CAD患者發生MACE的危險因素,miR-665是保護因素,提示檢測circNPHP4、miR-665水平可判斷患者預后,有利于對患者進行危險分層,對臨床治療具有一定的指導意義,但其臨床應用仍需擴大樣本量做進一步研究。

綜上所述,CAD患者血清circNPHP4表達水平升高,miR-665表達水平降低。血清circNPHP4、miR-665水平與冠狀動脈Gensini評分相關,是CAD患者發生MACE的影響因素,可作為評估患者病情與預后的標志物。