載脂蛋白E背景E1A激活基因阻遏子轉基因小鼠建立及鑒定

趙曉杰, 閆 冰, 劉 丹, 張大力, 何佳奇

北部戰區總醫院 心血管內科,遼寧 沈陽 110016

載脂蛋白E(apolipoprotein E,ApoE)蛋白是一種富含精氨酸的血漿載脂蛋白,參與乳糜微粒殘體、極低密度脂蛋白和高密度脂蛋白的一些亞類等脂質的代謝,與特定細胞表面的受體和硫酸肝素蛋白聚糖相互作用,將其從血漿循環中清除[1]。為研究ApoE與人類疾病的關系,如動脈粥樣硬化[2]、肥胖[3]、糖尿病[4]及阿爾茲海默癥[5]等,ApoE背景(ApoE-/-)小鼠作為實驗動物模型被廣泛應用。E1A激活基因阻遏子(cellular repressor of E1A-stimulated genes,CREG)是一種含有220個氨基酸的進化保守的糖蛋白,結構類似于氧化還原酶,具有高度保守性,人類與小鼠的CREG基因高度同源[6]。本課題組前期研究發現,CREG可以通過調節不同細胞增殖、分化、凋亡等,對心血管及代謝疾病產生影響,且在調節肝糖脂代謝方面也具有重要作用[7]。本研究旨在建立ApoE-/-CREG轉基因(CREGTg)小鼠模型,為進一步探討CREG在動脈粥樣硬化等心血管疾病中的作用及機制提供新的實驗工具。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與配繁方案 3只雄性ApoE-/-小鼠和9只雌性CREGTg小鼠均購自江蘇集萃藥康生物科技有限公司。首先,將雄性ApoE-/-小鼠與雌性CREGTg小鼠進行交配,獲得雄性ApoE+/-小鼠和雌性ApoE+/-CREGTg小鼠(或雌性ApoE+/-小鼠和雄性ApoE+/-CREGTg小鼠),再將兩者進行交配,以獲得ApoE-/-CREGTg小鼠。

1.2 主要試劑 CREG一抗、ApoE一抗(英國Abcam公司);Gapdh抗體(美國Cell Signaling Technology);HRP標記的二抗(美國Jackson Immuno Research);逆轉錄試劑盒(日本TAKARA);蛋白裂解液RIPA(美國Thermofisher Scientific);引物合成(生工生物工程股份有限公司)。

1.3 基因型鑒定 子代小鼠滿4周時,分籠并打耳釘進行編號。提取鼠耳基因組DNA,具體方法:將小鼠耳放于裂解液中(含蛋白酶K),55℃水浴鍋2 h,95℃水浴鍋5 min終止消化,12 000 r/min離心5 min,上清即為提取的DNA。然后進行聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction,PCR)擴增,引物見表1。反應體系:gDNA Template 2 μl,10×Taq master mix 10 μl,Primer mix(10 mol/L)1 μl,水補至20 μl。反應條件:(1)95℃、5 min;(2)95℃、30 s;(3)58℃、30 s;(4)72℃、30 s;(2)～(4)共40個循環;(5)72℃、3 min;(6)25℃保持。將擴增后的PCR產物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳及基因型鑒定。

表1 ApoE-/-CREGTg小鼠基因型鑒定

1.4 熒光定量PCR檢測CREG轉基因表達 選取8周齡雄性ApoE-/-小鼠及ApoE-/-CREGTg小鼠各3只,處死后分離各組小鼠脂肪組織和脾組織,采用Trizol法提取脂肪組織和脾組織的總RNA。按照試劑盒說明書進行逆轉錄反應。CREG正向引物TCTAAAAGACCTAACCGGAA,反向引物ACCGGAACGGCACTGGTCAAC;GAPDH正向引物AGGTCGGTGTGAACGGATTTG,反向引物GGGGTCGTTGATGGCAACA。相對表達量用2-△△CT表示。

1.5 蛋白免疫印跡法檢測CREG蛋白表達 選取8周齡雄性ApoE-/-小鼠及ApoE-/-CREGTg小鼠各3只,處死后取20 mg脂肪組織和20 mg脾組織,加入200 μl蛋白裂解液對組織進行裂解,4℃放置30 min,12 000 r/min離心5 min,上清即為提取蛋白。BCA法測定蛋白濃度。采用SDS-PAGE膠對細胞總蛋白進行電泳。一抗采用抗CREG抗體,二抗為HRP標記的抗體,Gapdh為內參基因。一抗4℃孵育過夜,二抗室溫孵育1 h后洗膜,再用化學發光試劑ECL對條帶進行顯影。采用Image-ProPlus 6.0軟件對條帶進行灰度分析。

2 結果

2.1 ApoE-/-CREGTg小鼠獲得情況 共有孕鼠13只,共產仔73只。對子代小鼠進行基因鑒定,共發現6種基因型,分別為ApoE+/+小鼠9只(12.33%),ApoE+/+CREGTg小鼠10只(13.70%),ApoE+/-小鼠19只(26.03%),ApoE+/-CREGTg小鼠16只(21.92%),ApoE-/-小鼠8只(10.95%),ApoE-/-CREGTg小鼠11只(15.07%)。見圖1。

圖1 小鼠基因型鑒定結果[a.PCR擴增鑒定CREG轉基因,CREG引物1=371 bp,引物2=360 bp;b.PCR擴增鑒定ApoE背景,野生型=155 bp,突變型=245 bp;本批次樣本中ApoE+/+小鼠:5,7;ApoE+/+CREGTg小鼠:無;ApoE+/-小鼠:3,9;ApoE+/-CREGTg小鼠:6;ApoE-/-小鼠:2;ApoE-/-CREGTg小鼠:1,4,8;對照組:10為C57BL/6J(ApoE+/+)小鼠;11為ApoE-/-CREGTg小鼠;12為水]

2.2 小鼠脂肪組織與脾組織CREG轉錄水平 ApoE-/-CREGTg小鼠脂肪組織與脾組織的CREG轉錄水平高于ApoE-/-小鼠,差異均有統計學意義(P<0.05)。見圖2。

圖2 熒光定量PCR檢測ApoE-/-CREGTg小鼠脂肪組織與脾組織CREG轉錄水平(a.脂肪組織;b.脾組織)

2.3 小鼠脂肪組織與脾組織CREG蛋白表達水平 ApoE-/-CREGTg小鼠脂肪組織與脾組織的CREG蛋白表達高于ApoE-/-小鼠,差異均有統計學意義(P<0.05)。見圖3。

圖3 蛋白免疫印跡法檢測ApoE-/-CREGTg小鼠脂肪組織與脾組織CREG蛋白表達(a、b.脂肪組織蛋白表達;c、d.脾組織蛋白表達)

由于生物物種具有雜合子優勢[17-20],本研究的F2代選取了鑒定后的雜合子小鼠,以提高小鼠品性及子代小鼠的穩定性。通過雄性ApoE+/-小鼠和雌性ApoE+/-CREGTg小鼠交配,成功獲得ApoE-/-CREGTg小鼠。熒光定量PCR和蛋白免疫印跡法檢測結果顯示,ApoE-/-CREGTg小鼠脂肪組織和脾組織的CREG基因轉錄水平高于ApoE-/-小鼠,差異有統計學意義(P<0.05);ApoE-/-CREGTg小鼠脂肪組織和脾組織的CREG蛋白表達高于ApoE-/-小鼠,差異有統計學意義(P<0.05),進一步驗證了該模型的可靠性及轉基因效率,提示可繁育ApoE-/-CREGTg小鼠動物模型用于動脈粥樣硬化等疾病發病機制的實驗研究。

綜上所述,本研究成功建立了ApoE-/-CREGTg小鼠模型,為深入闡明CREG對動脈粥樣硬化等心血管疾病的調控作用及機制提供了新的實驗工具。

3 討論

ApoE是分子量為34 kD的糖蛋白,參與脂質在不同組織或細胞的分布和再分布,具有抗氧化、抗炎和抗動脈粥樣硬化的特性。ApoE蛋白的主要功能是介導血漿或組織間液中脂蛋白或脂質復合物與特定細胞表面受體結合,小鼠ApoE基因缺陷會影響極低密度脂蛋白和乳糜微粒的清除[1,8-10]。Piedrahita等[11]通過同源重組在胚胎干細胞中操縱ApoE基因,在實驗室中成功產生了第一個ApoE-/-小鼠品系。與野生型小鼠比較,ApoE-/-小鼠的血漿總膽固醇水平明顯升高[12],使其成為動脈粥樣硬化疾病及相關藥物研發的重要工具。本課題組前期研究發現,CREG能夠抑制血管內皮細胞凋亡,促進血管內皮細胞增殖,進而促進冠狀動脈支架內皮化[6,13-16]。為進一步探究CREG對動脈粥樣硬化等心血管疾病的調控作用及機制,本課題組擬在ApoE-/-小鼠中過表達CREG,從而建立ApoE-/-CREGTg小鼠模型,以便更直接地研究CREG對動脈粥樣硬化性疾病的影響。