乙型肝炎病毒感染對外周血單個核細胞分泌功能的影響*

邵華卿 張春蕾 陳旭東 王 磊

1.上海中醫藥大學附屬龍華醫院檢驗科 (上海, 200032) 2.上海中醫藥大學附屬龍華醫院急診科 3.上海中醫藥大學附屬龍華醫院肝病科

慢性乙型病毒性肝炎(CHB)是我國傳染病重大傳染病之一,乙型肝炎病毒(HBV)持續感染是導致本病發生的關鍵[1,2]。外周血單個核細胞(PBMC)包含淋巴細胞和單核細胞等,在HBV的清除過程中發揮著重要的作用,除能夠提呈抗原、直接清除感染病毒的肝細胞外,還可以分泌大量細胞因子參與病毒的清除[3,4]。血液中的各類細胞因子具有強大免疫調節功能,能夠激活或抑制機體細胞免疫和體液免疫從而影響HBV的清除,研究顯示細胞因子平衡的紊亂、關鍵因子的缺乏可能是導致HBV慢性感染的重要因素[5-9]。了解病毒刺激后細胞因子的分泌時間變化規律有助于選擇恰當實驗時機提高實驗研究的準確性。

1 資料與方法

1.1 試劑 用于分離PBMC的血液樣本全部來自龍華醫院招募的健康志愿者。乙型肝炎病毒取自HepG 2.2.15細胞濃縮上清液。CBA檢測試劑盒：IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17A、TNF-α、IFN-γ等細胞因子捕獲微球、CBA Human Soluble Protein Master Buffer Kit均購自BD公司。Amicon Ultra-15(100 kd)超濾離心管購自Millipore公司。

1.2 方法

1.2.1 PBMC的分離 無菌條件下采集各組患者及健康志愿者外周血10 ml后PBS等倍稀釋混勻;50 ml的離心管中加入2倍血液的淋巴細胞分離液,將混勻的血液緩慢加入在含有淋巴細胞分離液的離心管中,室溫1 500 rpm/min離心20 min;離心后離心管內分為3層：上層為血清和PBS液,下層主要為紅細胞,中層為淋巴細胞分離液。在上、中層界面處以單個核細胞為主的灰白色云霧帶;輕輕抽取灰白色云霧層的細胞加2倍PBS懸浮,依次1 200 rcf/min、1 000 rcf/min各10 min、5 min洗滌兩次;洗滌結束加入適量含血清RPMI 1640培養基重懸,加入6孔板培養每孔加入1.5 ml培養基,調整細胞濃度為5×105個/孔,置于37℃ 5% CO2培養箱中。

1.2.2 乙型肝炎病毒對PBMC的干預 以含血清及G418(0.2 μg/ml)的DMEM高糖培養基常規培養HepG 2.2.15細胞,3 d后收集培養上清液,Millipore-Amicon Ultra-15(100 kd)離心管,2 500 rpm離心25 min,調整HBV DNA含量>5×106IU/ml。對照組以全血清培養基加入培養4 h的PBMC中共培養;病毒組將含有乙型肝炎病毒的HepG2.2.15培養上清,以每孔病毒濃度為5×105IU/ml加入培養4 h的PBMC中共培養;分別在共培養4 h、8 h、12 h、24 h、36 h、48 h后收集培養上清進行細胞因子檢測。

1.2.3 細胞因子檢測 細胞因子檢測采用流式多因子檢測技術(CBA)。

1.3 統計學方法 數據統計分析采用SPSS 19.0 軟件,計量資料以均值±標準差表示。同一時間點組間比較采用獨立樣本t檢驗;同組不同時間點比較采用單因素方差分析,如方差不齊采用Games-Howell。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 空白對照組各細胞因子動態變化結果 空白對照組各細胞因子含量變化曲線較為平緩,IL-2、IL-17A含量隨時間變化呈上升趨勢48 h內未達到峰值;IL-4、IL-6含量達峰時間為36 h,IL-10為12 h,TNF-ɑ為8 h,IFN-γ為4 h;各因子各時間點含量較4 h均有不同程度差異(均P<0.05)。

2.2 病毒干預組各細胞因子動態變化 病毒干預組IL-2的含量隨時間變化呈上升趨勢48 h內未達到峰值;IL-4、IL-6、IL-10、IL-17A、IFN-γ、TNF-ɑ含量隨時間變化呈先上升后下降趨勢,其中IL-4、IL-17A、IFN-、TNF-ɑ含量達峰時間為8 h,IL-10為24 h,IL-6為36 h;各因子各時間點含量較4 h均有不同程度差異(均P<0.05)。

2.3 兩組細胞因子變化 見表1～7。

表1 IL-2檢測結果

表2 IL-4檢測結果

表3 IL-6檢測結果

表4 IL-10檢測結果

表5 IL-17A檢測結果

表6 TNF-ɑ檢測結果

表7 IFN檢測結果

3 討論

細胞因子是由活化免疫細胞和非免疫細胞分泌的一種低分子可溶性蛋白質,具有調節免疫、血細胞生成、細胞生長以及損傷組織修復等多種功能。根據不同來源可分為淋巴因子(LK)、單核因子(MK)及非淋巴細胞、非單核因子,各類細胞因子通過旁分泌、自分泌或內分泌等方式發揮作用,形成了十分復雜的細胞因子調節網絡,參與人體多種重要的生理功能。LK、MK主要參與了機體免疫的調控,在構建機體免疫防御、維持正常免疫平衡上發揮著重要的作用,細胞因子調節網絡是紛繁復雜的,不但各因子之間、各因子與細胞之間相互關聯、相互影響,同時又是動態變化的。因此,了解各個細胞因子分泌時間特征,將有助于了解機體免疫應答過程,準確選擇藥物干預時間節點,使實驗研究更加準確有效。

Th1/Th2細胞因子在HBV侵入人體時發揮著重要的抗病毒作用,Th1細胞因子主要包括IL-2、IFN-、TNF-ɑ等,IL-2具有促進淋巴細胞生長、提高吞噬細胞的活性、刺激分泌免疫干擾素、誘導和增強自然殺傷細胞和細胞毒性T淋巴細胞的效應[10,11]。IFN-主要由活化T細胞產生,通過激活APC功能和巨噬細胞、NK、CTL細胞功能發揮抗病毒作用[12,13]。TNF-ɑ可殺傷腫瘤細胞、誘導炎癥反應、增強CTL對靶細胞殺傷[14]。Th2細胞因子主要包括IL-4、IL-6、IL-10等。IL-4可促進B細胞的增殖分化、促進IgE、IgG的產生并抑制Th1分泌IFN-γ、IL-2等細胞因子,下調細胞免疫應答,誘導Th2細胞生成[15]。IL-6可促進B細胞增殖分化,合成分泌Ig,促進T細胞增殖分泌,參與炎癥反應[16]。IL-10可抑制巨噬細胞功能,降低抗原遞呈作用,減少單核因子生成;抑制Th1細胞分泌IL-2、IFN-γ等細胞因子,下調細胞免疫;促進B細胞增殖和抗體生成,上調體液免疫[17]。

研究發現Th1/Th2型細胞因子平衡失調,可導致HBV清除障礙,HBV感染慢性化可能與Th2細胞因子增高有關,IL-17A、TNF-ɑ的高表達可加重了肝臟炎癥反應[9]。HBeAg可以明顯抑制Th1型細胞因子IFN-γ的產生,促進Th2型細胞因子IL-6和IL-10分泌,上調外周血PBMC表面PD-1/PD-L1的表達,從而有利于形成對HBV感染的免疫耐受[8]。本實驗結果證實HBV干預后PBMC分泌抗病毒因子IFN-γ減少,免疫抑制性因子IL-10、炎癥因子IL-6、IL-17A、TNF-ɑ等均不同成都升高,與既往體內研究一致,同時觀察了IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17A、IFN-γ、TNF-ɑ各細胞因子分泌高峰和時間動態曲線,為進一步的藥物干預選擇合適的檢測時間節點研究提供了參考。